Uncle是一個檢測穩(wěn)定性的一體化平臺，可通過一臺儀器實現(xiàn)12種不同的應(yīng)用。它采用熒光，靜態(tài)光散射（SLS）和動態(tài)光散射（DLS）的檢測方法表征蛋白質(zhì)穩(wěn)定性（圖1）。 多種檢測方法意味著可以對同一種樣品進(jìn)行多參數(shù)檢測，例如熱熔，聚集和顆粒大小。 為了得到完整的信息，需要同時采用光散射和熒光的檢測方法，即使聚集掩蓋了蛋白質(zhì)顆粒的變化，熒光也可以檢測到蛋白質(zhì)的展開。另外，溫度控制（15-95°C）和樣品的密封性也為樣品的表征提供了更大的靈活性。樣品加入到小體積的石英Unis管中，一次可以運行48個樣品，因此可以更徹底地表征更多的生物制劑和配方。
 

1. 半數(shù)變性溫度（Tm）

通過內(nèi)源性熒光直接檢測蛋白質(zhì)的展開，確定其熔解溫度。隨著蛋白質(zhì)的展開和氨基酸的重排，色氨酸和酪氨酸的熒光變化表明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化。內(nèi)源性熒光是直接觀察蛋白質(zhì)解折疊的方法之一，即使在聚集開始后也可以這樣檢測，這與基于光散射或量熱法的方法不同。這種檢測方式可以對構(gòu)建體的穩(wěn)定性進(jìn)行排序或比較不同的配方以獲得最有利的條件。在大多數(shù)情況下，隨著蛋白質(zhì)的展開，熒光強度會發(fā)生變化或峰值漂移。但這種檢測方式也有很多例外，最好的方式是對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Uncle檢測完整的熒光光譜，以確保擁有所需的所有數(shù)據(jù)，并以您需要的所有方式進(jìn)行分析。
 
Uncle通過直接測量內(nèi)在熒光的展開來確定蛋白質(zhì)的熔化溫度。隨著蛋白質(zhì)的展開和氨基酸的重排，色氨酸和酪氨酸的熒光變化表明其構(gòu)象也發(fā)生變化。固有熒光是觀察蛋白質(zhì)解折疊的唯一直接方法之一，即使在聚合開始后也可以這樣做，這與基于光散射或量熱法的方法不同。 在大多數(shù)情況下，隨著蛋白質(zhì)展開，熒光強度發(fā)生變化或峰值漂移。 但也有例外的時候，最好的方法是對數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)性分析。Uncle測量完整的熒光光譜，以確保擁有需要的所有數(shù)據(jù)，并以您需要的方式進(jìn)行分析。
 
2.聚集起始溫度（Tagg）
通過在兩個不同波長下使用SLS同時檢測小顆粒和大顆粒，了解蛋白質(zhì)在熱升溫過程中如何以及何時聚集，可以對您的構(gòu)建體或制劑進(jìn)行排序，找到防止或延遲聚集開始的輔料。 由于蛋白質(zhì)可以展開也可以聚集，因此同時檢測Tm和Tagg可以方便確定蛋白何時展開，以及導(dǎo)致聚集的原因。 使用不依賴顆粒大小變化的熒光方法，即使在聚集已經(jīng)開始之后也可以測量Tm。

1. 用SYPRO熒光染料檢測半數(shù)變性溫度

差示掃描熒光測定法（DSF）是確定熔融溫度的經(jīng)典高通量方法之一。蛋白質(zhì)可與外在染料如SYPRO^®Orange結(jié)合使用，當(dāng)它與未折疊蛋白質(zhì)的疏水表面結(jié)合時，會發(fā)生熱變換。 該應(yīng)用可用于蛋白質(zhì)中很少或沒有色氨酸殘基的情況，或評估濃度非常低的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的情況。 與Uncle上的其他所有應(yīng)用程序一樣，該軟件簡化了數(shù)據(jù)分析，以節(jié)省時間。 

 
4.△G（吉布斯自由能變）
強制降解是室溫穩(wěn)定性評估的既定替代品，但熱升溫方法并不總能區(qū)分相似穩(wěn)定性的條件。 對于這些棘手的問題，ΔG值可提供蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的定量檢測，它可在正交應(yīng)力條件下測量。 通過將蛋白質(zhì)暴露于化學(xué)變性劑中并測量其所產(chǎn)生的熒光變化，可以計算蛋白構(gòu)象展開所需的能量。

1. 等溫穩(wěn)定性

等溫穩(wěn)定性是穩(wěn)定性評估的另一種方法。不是將溫度升高以引起熔化轉(zhuǎn)變，而是將樣品在略低于預(yù)期Tm的溫度下保持更長時間。 將樣品密封在Uni比色管中，溫度可保持?jǐn)?shù)小時或數(shù)天而不會蒸發(fā)。選擇在熒光和SLS模式下同時檢測樣品的構(gòu)象展開和聚集，如果想了解分子或聚集體的大小如何隨時間變化，請選擇DLS。

 
6.熱變性恢復(fù)
熱變性恢復(fù)可以檢測蛋白構(gòu)象展開的可逆性，或監(jiān)測溫度變化如何影響分子。選擇一個溫度（或幾個），并上下升高，觀察蛋白質(zhì)是否可以在選擇的制劑中重新折疊。選擇熒光，SLS模式同時檢測蛋白構(gòu)象展開，重折疊和聚集。如果想監(jiān)測蛋白質(zhì)的構(gòu)象隨著流體動力學(xué)粒徑大小和時間的改變，可選擇收集DLS數(shù)據(jù)。
 
7.粒度與多分散性系數(shù)
DLS是一種高靈敏度的工具，用于測量溶液中蛋白質(zhì)和小分子的流體動力學(xué)粒徑大小。 Uncle的靈敏度符合行業(yè)最高標(biāo)準(zhǔn)，可以在低至0.05mg/mL的濃度下檢測蛋白質(zhì)的大小。 使用DLS可以識別聚集體或雜質(zhì)的存在，并確認(rèn)分子是否是期望的大小。另外，可以15-95°C之間的任何溫度下獲得粒徑信息。
多分散性是樣品不均勻性的衡量標(biāo)準(zhǔn)，如果顆粒尺寸不均勻，將檢測到較高的多分散性值。 低多分散性值表明顆粒尺寸更均勻。Uncle在檢測粒徑的同時不使用任何額外的蛋白質(zhì)或添加任何時間，即可獲得有關(guān)多分散性的更多信息，并可在相同樣品上進(jìn)行其他實驗。
 
8.升溫粒度
確定或確認(rèn)生物制劑熱穩(wěn)定性的另一種方法是用DLS測量蛋白質(zhì)的流體動力學(xué)粒徑大小，因為蛋白粒徑在熱應(yīng)激下會經(jīng)歷構(gòu)象變化。通過DLS測量粒徑的增加是蛋白構(gòu)象展開的證據(jù)。然而，在聚集開始后，僅用光散射不能確定真正的熔融溫度。 Uncle的多種檢測模式可更清晰地了解蛋白質(zhì)構(gòu)象的展開和聚集，從而可靠地監(jiān)測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。
  

9．kD：（擴散相互作用系數(shù)）
Uncle能確定蛋白質(zhì)在不同配方中的擴散相互作用系數(shù)，以幫助預(yù)測其膠體穩(wěn)定性或聚集的可能性。在結(jié)構(gòu)和制劑配方縮小到更小范圍后，使用這種非侵入式技術(shù)可以驗證優(yōu)化后的條件。另外，只需一次實驗和幾分鐘的時間即可以同時獲得B₂₂值。

10.B₂₂：（第二維里系數(shù)）
第二維里系數(shù)是研究樣品中蛋白質(zhì)分子之間相互作用的既定且有價值的方法。在測量k_D的同時，使用完全相同的樣本，即可獲得獨立計算的B₂₂測量結(jié)果，通過它幫助預(yù)測蛋白質(zhì)在制劑配方中的聚集傾向。正B₂₂值表示蛋白質(zhì)分子之間的凈排斥力，而負(fù)B22值表明蛋白質(zhì)易于自我結(jié)合。

11.G₂₂ : (Kirkwood-Buff Integral)
G₂₂是一種更嚴(yán)格的檢測蛋白質(zhì)的凈自身相互作用參數(shù)的方法，特別是在高濃度時，G₂₂可以確定樣品中的蛋白質(zhì)-溶劑和蛋白質(zhì)-溶質(zhì)相互作用。與B₂₂不同，陰性G₂₂值表示蛋白質(zhì)分子之間的凈排斥力，而陽性G₂₂表示可能的自結(jié)合。這節(jié)省寶貴的樣本和時間，可以對B₂₂數(shù)據(jù)重新分析，以獲得在蛋白高濃度時的G₂₂值。

黏度

Uncle可以比較不同蛋白質(zhì)的黏度，并在制劑開發(fā)過程中更早地了解配方成分或賦形劑如何增加或降低溶液的黏度。Uncle需要的樣品量比傳統(tǒng)的粘度計小，因此可以用更少的蛋白質(zhì)篩選更多的條件。
 

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