產品簡介：

Ø EMSA/Gel-Shift試劑盒(EMSA/Gel-Shift Kit)是用于EMSA(也稱gel shift)研究的一個試劑盒。通過EMSA可以研究目的蛋白

和特定的DNA序列的結合情況，從而可以研究細胞內一些轉錄因子的激活水平。本試劑盒提供了進行EMSA實驗的探針標記、蛋白
和DNA結合以及EMSA上樣等的主要試劑，使EMSA實驗變得簡單方便。

Ø 每個EMSA/Gel-Shift試劑盒足夠標記10-20次探針，足夠進行100個蛋白和探針的結合反應。




包裝清單：

T4 Polynucleotide Kinase 100U
T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X) 100微升
Nuclease-Free Water 1毫升
探針標記終止液 100微升
5M 醋酸銨 600微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) 200微升
EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍色，10X) 200微升
EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X) 200微升
TE 2毫升
說明書 1份




保存條件：

-20℃保存，一年有效。



注意事項：

Ø 需自備待標記的EMSA探針，需自備用于探針標記的同位素，需自備EMSA膠配制的相關試劑。


Ø 細胞核蛋白的抽提可以使用碧云天生產的細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒。
Ø 如需做super-shift，需自備用于super-shift的抗體。


Ø 本實驗涉及到同位素的操作，請嚴格按照同位素的相關管理條例進行操作。
Ø 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。


使用說明：

1.
探針的標記：


(1)
如下設置探針標記的反應體系：
待標記探針 (1.75pmol/微升)
2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X)
1微升
Nuclease-Free Water
5微升
[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml)
1微升
T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/微升)
1微升
總體積
10微升

按照上述反應體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。


(2)
使用水浴或PCR儀，37℃反應10分鐘。
(3)
加入1微升探針標記終止液，混勻，終止探針標記反應。
(4)
再加入89微升TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率。通常標記的效率在30％以上，即總放射性的30%以上標
記到了探針上。為實驗簡便起見，通常不必測定探針的標記效率。
(5)
標記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。


2. 探針的純化：

通常為實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結果。如需純化，可以按照如

下步驟操作：
(1) 對于100微升標記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。
(2) 在-70℃至-80℃沉淀1小時，或在-20℃沉淀過夜。
(3) 在4℃，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉淀。
(4) 在4℃，12,000g-16,000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。
(5) 加入100微升TE，完全溶解沉淀。標記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在
-20℃。

3. EMSA 膠的配制：

(1) 準備好倒膠的模具。可以使用常規的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當的模具。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于
干膠等后續操作。為得到更好的結果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。
(2) 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結果影響不大)。
TBE buffer (10X)
1毫升
重蒸水
16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)
2毫升
80% 甘油
625微升
10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate)
150微升
TEMED
10微升

(3) 按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產生氣泡，

并加上梳齒。如果發現非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理。

4. EMSA結合反應：

(1)
如下設置EMSA結合反應(預期的結果參見圖1)：
陰性對照反應：

Nuclease-Free Water
7微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子
0微升
標記好的探針
1微升
總體積
10微升
樣品反應：

Nuclease-Free Water
5微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子
2微升
標記好的探針
1微升
總體積
10微升


探針冷競爭反應：

Nuclease-Free Water
4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子
2微升
未標記的探針 1微升
標記好的探針
1微升
總體積
10微升
突變探針的冷競爭反應：

Nuclease-Free Water
4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子
2微升
未標記的突變探針 1微升
標記好的探針
1微升
總體積
10微升


Super-shift反應：

Nuclease-Free Water
4微升
EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X)
2微升
細胞核蛋白或純化的轉錄因子
2微升
目的蛋白特異抗體
1微升
標記好的探針
1微升
總體積
10微升


(2) 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而消除可能發生的探
針和蛋白的非特異性結合，或者讓冷探針優先反應。然后加入標記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。
(3) 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結合，建

議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣
緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液，至能觀察到藍顏色即可。


5. 電泳分析：

(1) 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘。預電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X
的EMSA上樣緩沖液(藍色)，以觀察電壓是否正常進行。
(2) 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多余的某個上樣孔內加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液
(藍色)，用于觀察電泳進行的情況。
(3) 按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩

沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。
(4) 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊

緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側逐漸覆蓋
住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭
起來。把濾紙側向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。
(5) 干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當儀器設備檢測。EMSA的典型分析結果可以參見下面的圖1。


圖1. 一個典型的EMSA/Gel-
Shift分析圖
1, 陰性對照反應(標記探針)；2, 常規反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白＋標記探針)；3, 探針冷競爭反應(含激活的

目的轉錄因子的核蛋白＋標記探針＋標記探針100倍量的未標記探針)；4, 突變探針的冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的
核蛋白＋標記探針＋標記探針100倍量的未標記突變探針)；5, Super-shift反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白＋標記探
針＋目的轉錄因子的特異抗體)。