isoCell是英國iotaSciences公司推出的一款基于GRID專li技術（專li號：WO2019197373A1）、高通量、高自動化的單細胞可視化分選培養系統。isoCell采用微射流技術，利用界面張力對細胞培養基（或干細胞涂層）進行重塑，在培養皿上雕刻出單獨的細胞腔室GRID（可以在6厘米培養皿上創建256個單細胞腔室GRID陣列），并將細胞以納升體積全自動地分配到各個GRID單細胞腔室中。isoCell可以避免邊界效應，利用其自帶的光學顯微鏡可以清楚地看到GRID室中的單細胞，以確保isoCell分選出的細胞100%為單細胞。isoCell可以將單細胞在GRID中培養成單克隆細胞系，培養過程中可以根據客戶需求進行換液操作，全流程可視化監控以保證每個單克隆細胞系均來自所挑選的單個細胞。

      通過isoCell單細胞可視化分選培養系統可以實現高通量、自動化、高成活率的單克隆細胞系構建、微生物分選與培養、單細胞分選、單細胞組學等功能。

isoCell應用領域
單克隆細胞系構建（高效、溫和、高度自動化地構建單克隆細胞系）

傳統構建單克隆細胞系技術受限于單細胞的高度敏感性，成功率較低，且無法保證每一個單克隆細胞系均來自單個細胞。isoCell采用GRID單細胞微腔室技術，可以高度自動化、溫和地培育單克隆細胞系，確保高達60%-70%的培育成功率。且整個操作流程均進行可視化驗證，保證每一個單克隆細胞系都來自單細胞。

在GRID上培育8天的單克隆細胞系

單細胞分選（100%準確的單細胞分選效率）

傳統單細胞分選方法無法保證所得的樣品中只有一個單細胞，而isoCell采用GRID單細胞腔室分離與光學信號驗證相結合的分選技術，能夠保證分選所得的單細胞樣品中只有一個單細胞。

單細胞分選前后的GRID細胞腔室

單細胞組學（極大地簡化單細胞組學步驟）
isoCell可以將1.5 µl至200 µl的單細胞樣品直接裝移至PCR管帶或96孔板中，無縫銜接后續單細胞測序scWGA流程，極大地簡化單細胞組學步驟。

單細胞的WGA結果

isoCell設備特點

- 全自動化流程
- 操作條件溫和，對單細胞無損傷
- 全培養、分析流程可視化追蹤
- 單細胞分離效率高達100%
- 單克隆細胞系構建成活率高
- 直接轉移到PCR管或96孔板
- 結構緊湊，體積小

      傳統單細胞分離手段無法保證所得的樣品內100%只有一個單細胞，可能有多個細胞或細胞團，導致下游的實驗出現誤差。且傳統構建單克隆細胞系技術受限于單細胞的高度敏感性，成功率較低，也無法保證每一個單克隆細胞系均來自單個細胞。isoCell采用的GRID單細胞腔室技術，可以保證100%準確的單細胞分選，并在GRID中高度自動化地直接培育單克隆細胞系，成活率高達60%以上，且通過全流程可視化監控，保證每一個單克隆細胞系均來自于挑選的單個細胞。isoCell分選、培養條件溫和，可以顯著提高單細胞克隆的存活率。同時isoCell可以將單細胞樣品按照特定的體積直接轉移到96孔板或PCR管中，無縫銜接單細胞下游應用，確保后續單細胞組學信息完整性。

應用案例

人類誘導多能干細胞(hiPSCs)的單細胞克隆

      人類誘導多能干細胞(hiPSCs)構建單克隆細胞系培養步驟繁瑣，細胞對異常的處理和操作非常敏感，傳統單細胞分選容易導致細胞和遺傳毒性應激的積累，進而導致不良分化和多能性喪失。

      使用isoCell可以溫和且自動化地將人類誘導多能干細胞(hiPSCs)進行單細胞分選并進行培養，高效地培養hiPSCs單克隆細胞系，顯著提高了細胞分離與克隆效率（如下圖所示）。

K562細胞單細胞測序

      傳統單細胞測序需對單細胞進行全基因組擴增（WGA），但傳統單細胞WGA受限于如何獲得單個細胞并轉移到小體積的WGA反應中。

      使用isoCell自動將K562細胞拾取并轉移至含3.5 µl scWGA試劑的PCR管中，并無縫銜接scWGA反應。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示（下圖），單細胞WGA的DNA樣本(+)中兩種基因均被特異性擴增，而陰性對照(-)沒有這兩種擴增產物，符合預期。

對人類誘導多能干細胞 (hiPSCs) Prime 編輯構建工程細胞系

      Prime 編輯可在 HEK3 基因座中高效精確插入三個核苷酸，用于構建工程細胞系hiPSCs。通過引入靶標特異性 pegRNA 來編輯單個或多個基因組位點，以進行精確有效的基因組編輯，促進疾病建模和功能遺傳學研究。

      Prime 編輯使用與逆轉錄酶融合的 Cas9 切口酶，將 DNA 序列從“Prime 編輯”引導 RNA (pegRNA) 復制到特定基因座。通過Prime 編輯將多西環素誘導型 Prime Editor 蛋白 (PE2) 整合到 iPSC 細胞系的AAVS1 基因組，之后使用isoCell分選轉入靶基因的hiPSCs細胞系，以確保細胞的單克隆性。（見上圖）

      該研究使用isoCell來確保工程細胞系的單克隆性與準確性。

參考文獻：Bharucha N, Ataam J A, Gavidia A A, et al. Generation of AAVS1 integrated doxycycline-inducible CRISPR-Prime Editor human induced pluripotent stem cell line[J]. Stem Cell Research, 2021, 57: 102610.

膠質母細胞瘤（GBM）通過表觀遺傳免疫編輯獲得骨髓相關轉錄程序以引發免疫逃逸

      研究人員通過將多形性膠質母細胞瘤干細胞 (GSC) 連續移植到免疫活性宿主中，發現 GSC 通過建立增強的免疫抑制腫瘤微環境來免疫逃逸。從機制上講，GSC通過表觀遺傳免疫編輯過程引起，其在免疫攻擊后強制執行 GSC 中穩定的轉錄和表觀遺傳變化。研究中使用Irf8敲除細胞系實驗證明，Irf8的激活是細胞免疫逃逸的一個重要因素，且在體內可能通過IFNγ介導的激活發生。該研究使用isoCell構建Irf8克隆敲除系。

參考文獻：Gangoso E, Southgate B, Bradley L, et al. Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion[J]. Cell, 2021, 184(9): 2454-2470. e26.
 

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