產(chǎn)品簡介：
 總一氧化氮檢測試劑盒(Total nitric oxide assay kit)采用了硝酸鹽還原酶(Nitrate reductase)還原硝酸鹽(nitrate)為亞硝酸鹽(nitrite)，然后通過經(jīng)典的Griess reagent檢測亞硝酸鹽，從而測定出總一氧化氮。一氧化氮本身極不穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)很快代謝為硝酸鹽和亞硝酸鹽，通過上述方法檢測出所有的硝酸鹽和亞硝酸鹽的量，就可以推算出總的一氧化氮的量。
 本試劑盒采用了NADH依賴性硝酸鹽還原酶(NADH depedent nitrate reductase)，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。采用廉價(jià)的NADPH依賴的硝酸鹽還原酶檢測總一氧化氮時(shí)，NADPH會(huì)對(duì)Griess reagent的檢測產(chǎn)生干擾，從而影響檢測結(jié)果。
 對(duì)亞硝酸鹽的檢測下限達(dá)到1微摩爾/升，在1-50微摩爾/升的范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。濃度過高的樣品可以適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測。
 樣品范圍廣，可以檢測細(xì)胞、組織、細(xì)胞或組織的培養(yǎng)液、血清、血漿或尿液等中一氧化氮的含量。酚紅和10%血清對(duì)測定無明顯干擾。
 樣品需要量少。根據(jù)樣品中一氧化氮的濃度不同，僅需0-45微升樣品。
 檢測速度快，僅需約30分鐘即可完成檢測。
 本試劑盒采用了間接的一氧化氮檢測方法，如需檢測實(shí)際的一氧化氮水平，可以采用碧云天生產(chǎn)的DAF-FM DA (NO熒光探針)(S0019)。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱 包裝
S0023-1 Nitrate Reductase 250微升
S0023-2 Nitrate Reductase Buffer 300微升
S0023-3 NADH 5mg
S0023-4 KNO3 (10mM) 1ml
S0023-5 Griess Reagent I 3ml
S0023-6 Griess Reagent II 3ml
— 說明書 1份
保存條件：
-20℃保存，半年有效。
注意事項(xiàng)：
 RPMI 1640等含有較高濃度硝酸鹽的培養(yǎng)液容易對(duì)本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，請(qǐng)盡量避免。
 由于檢測過程中有還原反應(yīng)，凡是影響還原反應(yīng)的氧化或還原試劑要注意避免，例如常用的還原劑DTT和巰基乙醇。
 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 樣品處理：
含有高濃度蛋白的樣品例如血清、含有高濃度血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，在加入Griess Reagent I后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀。可以取50微升樣品，加入50微升Greiss Reagent I進(jìn)行測試，觀察是否產(chǎn)生沉淀。如果產(chǎn)生沉淀，則可以把樣品沸水浴加熱5分鐘，以變性蛋白，然后12,000g離心5分鐘，取上清用于后續(xù)的測定。對(duì)于細(xì)胞或組織樣品可以用碧云天生產(chǎn)的RIPA裂解液(弱)(P0013D)或Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)進(jìn)行裂解。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：
用樣品所使用的溶液把10mM KNO3稀釋成2、5、10、20、50微摩爾/升。例如樣品為細(xì)胞裂解液，則用該裂解液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；樣品為細(xì)胞培養(yǎng)液，則用該培養(yǎng)液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
3. 試劑的準(zhǔn)備：
加約1ml蒸餾水或MilliQ級(jí)純水至5mg NADH中，顛倒混勻溶解后，再用蒸餾水或MilliQ級(jí)純水定容至3.2ml，配制成2mM NADH，除立即使用的部分外，其余NADH溶液必須立即分裝后-70℃凍存。Nitrate reductase在臨用前取出，試劑盒中的其余各種試劑在冰浴上溶解。Griess Reagent I和Griess Reagent II在使用前需達(dá)到室溫。
4. 酶混合液的配制：
配制方法參考下表：
產(chǎn)品編號(hào) 1個(gè)檢測 5個(gè)檢測 10個(gè)檢測 20個(gè)檢測 50個(gè)檢測
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 15微升 75微升 150微升 300微升 750微升
Nitrate Reductase 5微升 25微升 50微升 100微升 250微升
Nitrate Reductase Buffer 5微升 25微升 50微升 100微升 250微升
NADH (2mM) 5微升 25微升 50微升 100微升 250微升
酶混合液 30微升 150微升
Weish 300微升 600微升 1500微升
注意：酶混合液配制后一定要注意充分混勻！酶液容易沉降！標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為您用于標(biāo)準(zhǔn)品稀釋時(shí)的稀釋液。例如用RIPA裂解液裂解的樣品，則標(biāo)準(zhǔn)品宜用RIPA裂解液稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液即為RIPA裂解液。
5. 按照30微升/孔，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品。
如果樣品中一氧化氮的濃度很高或樣品數(shù)量有限，可以加入較小體積的樣品，體積不足部分用樣品所使用的溶液補(bǔ)足。例如用RIPA裂解液裂解的細(xì)胞樣品僅用了10微升，則加入20微升RIPA裂解液以補(bǔ)足體積。
6. 每孔加入30微升酶混合液，輕輕混勻。
7. 30℃反應(yīng)20分鐘。
可以在30℃的培養(yǎng)箱或其它合適的保溫設(shè)備內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。如果沒有合適的儀器設(shè)備，也可以20-30℃室溫反應(yīng)20-60分鐘。延長反應(yīng)時(shí)間不會(huì)影響檢測結(jié)果。另外，不可在37℃進(jìn)行反應(yīng)。
8. 每孔加入50微升室溫Griess Reagent I，輕輕混勻。
9. 每孔加入50微升室溫Griess Reagent II，輕輕混勻。
可以在側(cè)擺搖床或水平搖床上輕輕搖動(dòng)。
10．540nm測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出樣品中一氧化氮的濃度。
如無540nm濾光片，520-560nm的濾光片也可以使用。如無酶標(biāo)儀或合適的濾光片，也可以通過目測比色，確定樣品中一氧化氮的濃度。目測比色時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品需要更為精細(xì)的濃度梯度。

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