產品簡介：
 一氧化氮合成酶檢測試劑盒(Nitric oxide synthase assay kit)可以檢測活細胞內總的一氧化氮合成酶的活性。如果和特異性的一氧化氮合成酶抑制劑配合使用，也可以檢測不同類型的一氧化氮合成酶的活性。
 本試劑盒提供了一種在生理條件下通過熒光檢測活細胞內一氧化氮合成酶活性的方法，不需要使用傳統方法所需的放射性同位素。本試劑盒采用了可以穿透細胞膜的最新一代一氧化氮熒光檢測探針DAF-FM DA (3-amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetate)，在提供充足的底物的條件下檢測細胞內的一氧化氮合成酶可以催化產生的一氧化氮量，從而檢測出一氧化氮合成酶的活性。詳細的檢測原理參考圖1。采用一些一氧化氮合成酶的抑制劑則可以測定出特定類型的一氧化氮合成酶的活性。例如，采用iNOS抑制劑，未加iNOS抑制劑測定出來的酶活力減去加了iNOS抑制劑測定出來的酶活力就是iNOS的酶活力。















圖1. 一氧化氮合成酶檢測試劑盒原理圖

 本試劑盒是目前為止世界上最先進的一種一氧化氮合成酶檢測試劑盒。和Calbiochem等多年前就開始提供的一氧化氮合成酶檢測試劑盒相比無需使用同位素，和Sigma等最近推出的基于熒光的一氧化氮合成酶檢測試劑盒相比采用了最新一代的熒光探針，靈敏度更高，特異性更好。本試劑盒的缺點是和其它熒光法一氧化氮合成酶檢測試劑盒一樣，僅能提供一氧化氮合成酶的相對活性。
 本試劑盒和檢測細胞內一氧化氮水平的不同之處在于提供了充足的底物L-Arginine和一些可以穿透細胞膜的反應輔助因子，確保一氧化氮合成酶的催化的一氧化氮合成不會受底物的量或輔助因子的量的限制，從而可以測定出細胞內一氧化氮合成酶活力。
 本試劑盒最適合用于貼壁的細胞或組織的一氧化氮合成酶的檢測，對懸浮細胞也可以進行檢測。
 本試劑盒可以測定100個樣品。

包裝清單：
產品編號 產品名稱 包裝
S0025-1 NOS檢測緩沖液(2X) 15毫升
S0025-2 精氨酸溶液 600微升
S0025-3 NADPH 2.3mg
S0025-4 DAF-FM DA(5mM) 20微升
— 說明書 1份
保存條件：
-20℃保存，DAF-FM DA需避光保存，半年有效。
注意事項：
 RPMI 1640等含有較高濃度硝酸鹽的培養液容易對本試劑盒的檢測產生干擾，請盡量避免。
 由于檢測過程中有還原反應，凡是影響還原反應的氧化或還原試劑要注意避免，例如常用的還原劑DTT和巰基乙醇。
 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 細胞或組織培養：
把待檢測的細胞或組織培養到96孔板內，通常以培養16-24小時后細胞為80-90％滿為宜。可以留至少一個孔作為沒有細胞的空白對照。
2. 試劑的準備：
NADPH溶液的配制：加入1ml MilliQ級純水，充分溶解并混勻，配制成2.5mM的NADPH溶液。分裝成小管，當日不使用的立即-70℃凍存。取適量2.5mM NADPH，用NOS檢測緩沖液稀釋成0.1mM NADPH。
NOS檢測緩沖液的配制：取適量NOS檢測緩沖液(2X)，加入等量MilliQ級純水，混勻即成NOS檢測緩沖液。
檢測反應液的配制：檢測反應液參考下表配制，即1個反應就配制100微升，10個反應就配制1毫升。
1個反應 10個反應 20個反應
NOS檢測緩沖液(2X) 50微升 500微升 1毫升
MilliQ級純水 39.8微升 398微升 796微升
精氨酸溶液 5微升 50微升 100微升
0.1mM NADPH 5微升 50微升 100微升
DAF-FM DA 0.2微升 2微升 4微升
檢測反應液總體積 100微升 1毫升 2毫升
參考上表依次加入各種試劑，混勻后即為檢測反應液。注意：DAF-FM DA較易下沉，配制時一定要注意把DAF-FM DA混勻。
3. 樣品的檢測：
細胞或組織內一氧化氮合成酶的活性檢測有如下兩種方法：
a. 邊刺激邊測定。對于短時間藥物等刺激(通常2小時以內)可以顯著提高一氧化氮合成酶活性的情況可以使用本方法。
 吸盡培養液，加入100微升檢測反應液。如果是懸浮細胞，可以將96孔板離心后吸去上清，或將生長良好的細胞直接從培養的器皿中離心收集后按照適當密度用NOS檢測緩沖液重懸后，按照每孔100微升均勻加入到96孔板中。
 再加入100微升檢測反應液，輕輕混勻。
 37℃細胞培養箱內孵育20-120分鐘。具體孵育時間因不同的刺激和不同的細胞而不同，需自行摸索。對于經典的LPS和γ-IFN共同刺激RAW 264.7細胞，誘導一氧化氮合成酶活力的提高，孵育120分鐘后檢測，可以觀察到刺激前后總的一氧化氮合成酶活力提高6-10倍。
 直接取該96孔板用熒光酶標儀檢測。以沒有細胞的孔為空白對照，激發波長為495nm，發射波長為515nm。用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀也可以進行檢測。
b. 先刺激后測定。對于需長時間刺激(通常6小時以上)才可以顯著提高一氧化氮合成酶活性的情況可以使用本方法。
 細胞或組織刺激后，吸盡培養液，加入100微升檢測反應液。如果是懸浮細胞，可以將96孔板離心后吸去上清，再加入100微升檢測反應液。
 再加入100微升檢測反應液，輕輕混勻。
 37℃細胞培養箱內孵育20-60分鐘。具體孵育時間因不同的刺激和不同的細胞而不同，需自行摸索。
 直接取該96孔板用熒光酶標儀檢測。以沒有細胞的孔為空白對照，激發波長為495nm，發射波長為515nm。由于波長的設置和FITC檢測時的波長設置非常接近，可以直接使用FITC的設置。用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀也可以進行檢測。
4. 樣品中特定的一氧化氮合成酶的檢測(本步驟可以和上述步驟3同時進行)：
 無論是邊刺激邊測定還是先刺激后測定，吸盡培養液后加入100微升含有適當濃度的特定一氧化氮合成酶抑制劑的NOS檢測緩沖液。
 再加入100微升檢測反應液，輕輕混勻。
 37℃細胞培養箱內孵育20-60分鐘或20-120分鐘。具體孵育時間因不同的刺激和不同的細胞而不同，需自行摸索。
 直接取該96孔板用熒光酶標儀檢測。以沒有細胞的孔為空白對照，激發波長為495nm，發射波長為515nm。由于波長的設置和FITC檢測時的波長設置非常接近，可以直接使用FITC的設置。用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀也可以進行檢測。
5. 一氧化氮合成酶相對活力的計算：如果以沒有刺激前樣品中一氧化氮合成酶的活力為1，那么刺激后：
樣品中一氧化氮合成酶相對活力＝(RFU已刺激－RFU空白)/(RFU未刺激－RFU空白)
RFU, relative fluorescence unit, 即為實際測定得到的相對熒光強度。
6. 特定一氧化氮合成酶相對活力的計算：例如檢測時加了iNOS的抑制劑，如果以沒有刺激前樣品中一氧化氮合成酶的活力為1，那么刺激后：
樣品中iNOS酶相對活力＝(RFU已刺激－RFU(抑制劑＋已刺激))/( RFU未刺激－RFU (抑制劑＋未刺激))

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