產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
 過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒(Catalase Assay Kit)是一種簡(jiǎn)單易行的通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞、組織或其它樣品中過(guò)氧化氫酶(Catalase)活性的試劑盒。在過(guò)氧化氫相對(duì)比較充足的情況下，過(guò)氧化氫酶可以催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生水和氧氣。殘余的過(guò)氧化氫在過(guò)氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物，產(chǎn)生紅色的產(chǎn)物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p-benzoquinonemonoimine)，最大吸收波長(zhǎng)為520nm。用過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣就可以計(jì)算出樣品中的過(guò)氧化氫酶在單位時(shí)間單位體積內(nèi)催化了多少量的過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)樗�和氧氣，從而可以�?jì)算出樣品中過(guò)氧化氫酶的酶活力。
 過(guò)氧化氫酶分布非常廣泛。在肝臟、腎臟和紅細(xì)胞中，過(guò)氧化氫酶的水平非常高，是清除能導(dǎo)致氧化損傷的過(guò)氧化氫的主要場(chǎng)所。
 過(guò)氧化氫酶的活性也可以用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A240，但蛋白質(zhì)或其它組份在A240附近都有比較強(qiáng)的吸收，會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。因此，用紫外法測(cè)定過(guò)氧化氫酶的活性，比較適合純化的過(guò)氧化氫酶。本試劑盒通過(guò)檢測(cè)A520來(lái)測(cè)定過(guò)氧化物酶催化下由過(guò)氧化氫氧化生色底物產(chǎn)生的紅色產(chǎn)物，受干擾的因素小，檢測(cè)靈敏度高，可以檢測(cè)出低達(dá)1U/ml的過(guò)氧化氫酶。
 本試劑盒可以檢測(cè)全血、紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物、血清、組織勻漿產(chǎn)物、細(xì)胞裂解產(chǎn)物等生物樣品中的過(guò)氧化氫酶的活性。一個(gè)試劑盒共可以進(jìn)行100次檢測(cè)。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱 包裝
S0051-1 過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液 60ml
S0051-2 過(guò)氧化氫 (約1M) 5ml
S0051-3 過(guò)氧化氫酶反應(yīng)終止液 50ml
S0051-4 顯色底物 20ml
S0051-5 過(guò)氧化物酶 20微升
— 說(shuō)明書 1份
保存條件：
-20℃保存，一年有效。 過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液和過(guò)氧化氫酶反應(yīng)終止液也可以4℃保存。
注意事項(xiàng)：
 待測(cè)的過(guò)氧化氫酶樣品，無(wú)論是純的過(guò)氧化氫酶還是細(xì)胞或組織裂解產(chǎn)物，在4℃通�？梢员４�1周，-70℃可以長(zhǎng)期保存，但-20℃保存后過(guò)氧化氫酶的活力會(huì)顯著下降。
 在檢測(cè)過(guò)程中加入過(guò)氧化氫酶反應(yīng)終止液后15分鐘內(nèi)需開始顯色反應(yīng)。
 過(guò)氧化氫不太穩(wěn)定，精確的過(guò)氧化氫濃度需參考本說(shuō)明書中的方法進(jìn)行測(cè)定。
 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a. 配制250mM過(guò)氧化氫溶液。本試劑盒提供的過(guò)氧化氫濃度約為1M。由于過(guò)氧化氫不是非常穩(wěn)定，使用前需自行測(cè)定過(guò)氧化氫的實(shí)際濃度。把濃度約為1M的過(guò)氧化氫用本試劑盒提供的過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液稀釋100倍，使過(guò)氧化氫的濃度約為10mM。測(cè)定A240。
過(guò)氧化氫(mM)=22.94 X A240
從而計(jì)算出本試劑盒提供的過(guò)氧化氫的實(shí)際濃度。然后再根據(jù)實(shí)際的過(guò)氧化氫濃度配制250mM過(guò)氧化氫溶液。
b. 配制5mM過(guò)氧化氫溶液。根據(jù)測(cè)定得到的實(shí)際過(guò)氧化氫濃度配制5mM過(guò)氧化氫溶液。
c. 配制顯色工作液。在冰浴上溶解顯色底物，適當(dāng)分裝后再使用，盡量避免反復(fù)凍融。其它試劑放置在冰浴上備用。取適當(dāng)量的過(guò)氧化物酶，按照1:1000的比例用顯色底物稀釋，配制成顯色工作液。例如取5μl過(guò)氧化氫酶，加入5ml顯色底物，混勻即得到5ml顯色工作液。
2. 樣品的準(zhǔn)備：
用適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀饧?xì)胞或組織(可以使用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)進(jìn)行裂解)。用本試劑盒提供的過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液稀釋樣品，裂解好的樣品至少加入等體積的過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液進(jìn)行稀釋。具體的稀釋倍數(shù)可以參考表1。
表1
樣品名稱 蛋白濃度 檢測(cè)時(shí)的樣品使用量 反應(yīng)時(shí)間 A520 (空白對(duì)照－樣品¬)
Blank － － － 1.26 (空白對(duì)照實(shí)測(cè)值)
Human red blood cell lysate 0.2mg/ml 4μl 2min 0.46
Rat liver lysase 0.3mg/ml 7.5μl 1min 0.57
Rat kidney lysate 0.3mg/ml 7.5μl 3min 0.42
Rat spleen lysate 0.3mg/ml 7.5μl 3min 0.16
Rat brain lysate 0.3mg/ml 15μl 3min 0.021
HepG2 lysate 2.0mg/ml 3μl 3min 0.32
Jurkat lysate 2.0mg/ml 3μl 3min 0.46
說(shuō)明：表中的數(shù)據(jù)僅供參考。對(duì)于相同的樣品，同樣的實(shí)驗(yàn)體系，測(cè)得的A520值和表1相比可能會(huì)有較大差異。如果實(shí)驗(yàn)體系不同，例如測(cè)得蛋白濃度的方法不同，使用的檢測(cè)波長(zhǎng)不同等，測(cè)得的A520值和我們提供的參考數(shù)值相比可能會(huì)有更大的差異。對(duì)于表中沒有列出的樣品，可以參考表中的類似樣品進(jìn)行檢測(cè)，然后再根據(jù)檢測(cè)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整蛋白濃度和樣品使用量，或反應(yīng)時(shí)間。通常對(duì)于完全未知的樣品，可以對(duì)樣品進(jìn)行1、10、20和50倍稀釋，然后各取10μl，反應(yīng)1分鐘。樣品稀釋后的濃度，最好可以使反應(yīng)體系中的過(guò)氧化氫在反應(yīng)1-5分鐘后減少30-50％左右，這時(shí)的檢測(cè)結(jié)果更加精確。
a. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備�？梢杂帽淘铺焐�產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)參考相應(yīng)的說(shuō)明裂解細(xì)胞樣品。
b. 組織樣品的準(zhǔn)備。可以用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)參考相應(yīng)的說(shuō)明裂解組織樣品。
c. 全血樣品的準(zhǔn)備。收集全血(whole blood)至一抗凝管內(nèi)，顛倒混勻。取100微升全血凍融一次，用過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液稀釋1000倍后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
d. 紅細(xì)胞裂解液的準(zhǔn)備。用抗凝管收集血液，顛倒混勻。取至少500微升全血4℃ 2500g離心5分鐘。棄上清，沉淀用冰冷的生理鹽水(0.9%氯化鈉)洗滌3次。用約5倍細(xì)胞體積的冰冷的去離子水，例如MilliQ純水，重懸細(xì)胞沉淀，冰浴10分鐘。使用前用過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液稀釋400倍后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：
a. 取0、12.5、25、50或75微升配制好的5mM過(guò)氧化氫溶液至1.5ml或0.5ml塑料離心管中，分別加入過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液至最后體積為100微升，混勻。
b. 各取4微升，加入到96孔板中的一個(gè)孔內(nèi)。加入200μl顯色工作液。25℃至少孵育15分鐘后測(cè)定A520，但孵育時(shí)間不宜超過(guò)45分鐘。(注：本步驟可以和樣品測(cè)定步驟中的最后一步同時(shí)進(jìn)行。)
4. 樣品測(cè)定：
表2
空白對(duì)照 (blank) 樣品 (sample)
樣品體積 0 μl x μl
過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液 40 μl 40-x μl
250mM過(guò)氧化氫溶液 10 μl 10 μl
a. 參考表2，取x微升(0-40微升)樣品至1.5ml塑料離心管中，加入過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液至體積為40微升(即加入40-x微升過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液)，混勻。再加入10微升250mM過(guò)氧化氫溶液，用移液器迅速混勻。參考表1，25℃反應(yīng)1-5分鐘。
b. 加入450微升過(guò)氧化氫酶反應(yīng)終止液，顛倒混勻或Vortex混勻以終止反應(yīng)。需在終止反應(yīng)后15分鐘內(nèi)完成下面的步驟c和步驟d。
c. 在一潔凈的塑料離心管內(nèi)加入40微升過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液，再加入10微升已終止并混勻的上述反應(yīng)體系，混勻。
d. 從上一步驟的50微升體系中取10微升加入到96孔板中的一個(gè)孔內(nèi)。加入200微升顯色工作液。
e. 25℃至少孵育15分鐘后測(cè)定A520，但孵育時(shí)間不宜超過(guò)45分鐘。
5. 樣品中過(guò)氧化氫酶酶活力的計(jì)算：
a. 計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線。A520＝k[過(guò)氧化氫酶微摩爾數(shù)]＋b，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出k和b的值。
b. 計(jì)算出樣品中殘余的過(guò)氧化氫摩爾數(shù)。
殘余過(guò)氧化氫酶微摩爾數(shù)＝(A520-b)/k
c. 過(guò)氧化氫酶酶活力單位的定義：1個(gè)酶活力單位(1 unit)在25℃，pH7.0的條件下，在1分鐘內(nèi)可以催化分解1微摩爾過(guò)氧化氫。
d. [樣品過(guò)氧化氫酶酶活力]＝[消耗過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)] X[稀釋倍數(shù)]/([反應(yīng)分鐘數(shù)]X[樣品體積] X[蛋白濃度])
[樣品過(guò)氧化氫酶酶活力]的單位為units/mg蛋白
[消耗過(guò)氧化氫摩爾數(shù)]＝[空白對(duì)照殘余過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)]－[樣品殘余過(guò)氧化氫酶微摩爾數(shù)]
[稀釋倍數(shù)]＝250
[反應(yīng)分鐘數(shù)]即為實(shí)際的反應(yīng)分鐘數(shù)
[樣品體積]為表2中的X微升，以毫升來(lái)表示即為X/1000毫升。
[蛋白濃度]為取X微升樣品時(shí)，樣品中的蛋白濃度，單位為mg/ml。

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