產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
 總谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒(Total Glutathione Assay Kit)是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)總谷胱甘肽(GSSG+GSH)的試劑盒。通過谷胱甘肽還原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH可以和生色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB和GSSG。適當(dāng)配制反應(yīng)體系，前后兩個(gè)反應(yīng)合并起來后，總谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相當(dāng)于一個(gè)顏色產(chǎn)生的限速因素，總谷胱甘肽的量就決定了黃色的TNB形成量。從而通過測(cè)定A412就可以計(jì)算出總谷胱甘肽的量。
 本試劑盒的具體反應(yīng)原理如下：



兩個(gè)反應(yīng)相合并：


 還原型谷胱甘肽是絕大多數(shù)活細(xì)胞中巰基的主要來源，對(duì)于維護(hù)蛋白巰基適當(dāng)?shù)难趸�還原狀態(tài)有重要作用，并且是動(dòng)物細(xì)胞中關(guān)鍵的抗氧化劑。總谷胱甘肽中通常90-95%為還原型谷胱甘肽。
 本試劑盒可以檢測(cè)動(dòng)物組織、血漿、紅細(xì)胞、和培養(yǎng)細(xì)胞或其它適當(dāng)樣品中總谷胱甘肽的含量。
 本試劑盒提供了蛋白去除試劑S，可以更加準(zhǔn)確地測(cè)定出含有蛋白的樣品中的總谷胱甘肽的量。
 本試劑盒的檢測(cè)下限為1μM。一個(gè)試劑盒共可以進(jìn)行100次檢測(cè)。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱 包裝
S0052-1 總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液 60ml
S0052-2 谷胱甘肽還原酶 12微升
S0052-3 還原型谷胱甘肽(GSH) 2mg
S0052-4 DTNB 2mg
S0052-5 蛋白去除試劑S 0.4g
S0052-6 NADPH 4mg
S0052-7 DMSO 1.5ml
— 說明書 1份
保存條件：
NADPH-20℃保存，其余4℃保存，半年有效。還原型谷胱甘肽配制成溶液后，需適當(dāng)分裝，-20℃保存至少3個(gè)月有效。DTNB溶解在DMSO中后，需適當(dāng)分裝，-20℃保存至少3個(gè)月有效。蛋白去除試劑S配制成溶液后可以4℃保存。NADPH溶解后，適當(dāng)分裝，-70℃保存。
注意事項(xiàng)：
 本試劑盒檢測(cè)時(shí)牽涉到氧化還原反應(yīng)，所有氧化劑或還原劑都會(huì)干擾本試劑盒的測(cè)定。特別是DTT、巰基乙醇等含有巰基的試劑會(huì)嚴(yán)重干擾本試劑盒的測(cè)定，請(qǐng)盡量避免。
 一定要嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)的溫度和反應(yīng)時(shí)間，否則需每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
 NADPH等試劑不太穩(wěn)定，要嚴(yán)格按照后續(xù)說明操作，謹(jǐn)防失活。
 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a. GSH儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的2mg GSH中加入667微升MilliQ級(jí)純水，溶解并混勻，即為GSH儲(chǔ)備液，濃度為10mM。除立即待用部分外，其余GSH儲(chǔ)備液適當(dāng)分裝后-20℃保存。
b. DTNB儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的2mg DTNB中加入1.33毫升本試劑盒提供的DMSO，溶解并混勻，即為DTNB儲(chǔ)備液。除立即待用部分外，其余DTNB儲(chǔ)備液適當(dāng)分裝后-20℃保存。
c. 蛋白去除試劑S溶液的配制：在本試劑盒提供的0.4克蛋白去除試劑S中加入8毫升MilliQ級(jí)純水，配制成8毫升5%的水溶液。4℃保存。
d. NADPH儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的4mg NADPH中加入100微升MilliQ級(jí)純水，溶解并混勻，即為NADPH儲(chǔ)備液。除立即待用部分外，其余NADPH儲(chǔ)備液適當(dāng)分裝后-70℃保存。
e. 40倍稀釋谷胱甘肽還原酶的配制：取1微升谷胱甘肽還原酶，加入39微升總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液，混勻，即成40倍稀釋的谷胱甘肽還原酶。
f. 總谷胱甘肽檢測(cè)工作液的配制：根據(jù)待檢測(cè)的樣品數(shù)參考下表配制適當(dāng)量的總谷胱甘肽檢測(cè)工作液，表中三種試劑按比例混合后即為總谷胱甘肽檢測(cè)工作液。
1個(gè)樣品 10個(gè)樣品 20個(gè)樣品
40倍稀釋谷胱甘肽還原酶 4.3 μl 43 μl 86 μl
DTNB儲(chǔ)備液 4.3 μl 43 μl 86 μl
總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液 150 μl 1.5 ml 3 ml
g．0.16mg/ml NADPH的配制：取2微升NADPH儲(chǔ)備液，加入500微升總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液，混勻即為0.16mg/ml NADPH。每檢測(cè)一個(gè)樣品需50微升0.16mg/ml NADPH。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：
把10mM GSH儲(chǔ)備液用蛋白去除試劑S溶液稀釋成50μM GSH溶液。然后依次稀釋成25、15、10、5、2μM GSH溶液。取50、25、15、10、5、2μM GSH溶液六個(gè)點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：由于GSH在蛋白去除試劑S溶液中不太穩(wěn)定，用蛋白去除試劑S溶液配制的GSH溶液必須新鮮配制后使用，不可凍存后再使用。
3. 樣品的準(zhǔn)備：
a. 組織樣品的準(zhǔn)備。取組織用液氮速凍，然后研成粉末。每10毫克研碎的組織粉末，加入30微升蛋白去除試劑S溶液，充分Vortex。再加入70微升蛋白去除試劑S溶液，用玻璃勻漿器充分勻漿(對(duì)于比較容易勻漿的組織可以不用液氮速凍等處理，而直接加入適量蛋白去除試劑S溶液進(jìn)行勻漿)。4℃放置10分鐘后，10,000g 4℃離心10分鐘，取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。樣品需暫時(shí)4℃保存，不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過10天。對(duì)于處理好的組織樣品通常需進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，稀釋倍數(shù)通常為5-20倍。
b. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備。請(qǐng)盡量使用新鮮的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，而不要使用凍存的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。PBS洗滌細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清。加入細(xì)胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑S溶液，即如果細(xì)胞沉淀為10微升，則加入30微升蛋白去除試劑S溶液，充分Vortex。(細(xì)胞沉淀的體積可以根據(jù)細(xì)胞沉淀的重量進(jìn)行估算。收集細(xì)胞前后分別對(duì)離心管進(jìn)行稱重，從而就可以計(jì)算出細(xì)胞沉淀的重量。10毫克細(xì)胞沉淀的體積可以粗略地看做10微升。) 然后利用液氮和37℃水浴對(duì)樣品進(jìn)行兩次快速的凍融。4℃或冰浴放置5分鐘。4℃，10,000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。樣品需暫時(shí)4℃保存，不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過10天。對(duì)于處理好的細(xì)胞樣品通常需進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，稀釋倍數(shù)可以高達(dá)20倍。
c. 紅細(xì)胞或血漿樣品的準(zhǔn)備。請(qǐng)盡量使用新鮮的血液進(jìn)行測(cè)定。600g離心10分鐘，沉淀為紅細(xì)胞，上清為血漿。對(duì)于紅細(xì)胞，用PBS洗滌兩次。取約50微升紅細(xì)胞沉淀或血漿，加入50微升蛋白去除試劑S溶液，充分Vortex。4℃或冰浴放置10分鐘。4℃，10,000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。樣品需暫時(shí)4℃保存，不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過10天。對(duì)于處理好的紅細(xì)胞樣品最后需稀釋10倍后再進(jìn)行后續(xù)的測(cè)定，而對(duì)于血漿樣品，應(yīng)直接取10微升進(jìn)行測(cè)定。
d. 對(duì)于一些谷胱甘肽含量特別低的樣品，可以通過冷凍干燥進(jìn)行濃縮后再進(jìn)行測(cè)定。
4. 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定：
a. 參考表1，使用96孔板，依次加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。加入150微升總谷胱甘肽檢測(cè)工作液后，混勻，25℃或室溫孵育5分鐘。
表1
空白對(duì)照 (blank) 標(biāo)準(zhǔn)曲線 (standard) 樣品(sample)
樣品或標(biāo)準(zhǔn)品 0 μl 10 μl x μl
蛋白去除試劑S溶液 10 μl 0 μl 10-x μl
總谷胱甘肽檢測(cè)工作液 150 μl 150 μl 150 μl
25℃或室溫孵育 5 min 5 min 5 min
0.16mg/ml NADPH 50 μl 50 μl 50 μl
b. 加入50微升0.16mg/ml NADPH溶液，混勻。
c. 立即用酶標(biāo)儀測(cè)定A412，每5分鐘測(cè)定一次或?qū)崟r(shí)測(cè)定，共測(cè)定25分鐘，測(cè)得5個(gè)數(shù)據(jù)。(說明：為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，可以在加入NADPH溶液混勻后25分鐘，僅測(cè)定一次A412)。如果儀器可以設(shè)置溫度，把溫度設(shè)置在25℃，否則就在室溫狀況下測(cè)定。如果酶標(biāo)儀不能測(cè)定A412，可以測(cè)定405-414nm附近范圍的吸光度。
5. 樣品中總谷胱甘肽含量的計(jì)算：
a. 單點(diǎn)測(cè)定法：即反應(yīng)25分鐘后僅測(cè)定一次吸光度。根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的不同吸光度作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出總谷胱甘肽的含量。實(shí)際計(jì)算出來的總谷胱甘肽的含量相當(dāng)于把氧化型谷胱甘肽的含量乘以2再加上還原型谷胱甘肽的含量。單點(diǎn)法測(cè)定相對(duì)比較便捷，而動(dòng)力學(xué)法測(cè)定則相對(duì)比較精確。
b. 動(dòng)力學(xué)測(cè)定法：先根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定得到的吸光度值計(jì)算出ΔA412/min。然后以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以ΔA412/min為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的ΔA412/min，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以計(jì)算出測(cè)定時(shí)樣品中總谷胱甘肽的含量。
c. 同時(shí)根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)、以及最初樣品的使用量，可以計(jì)算出每毫克組織或細(xì)胞中的總谷胱甘肽的含量。對(duì)于細(xì)胞樣品，也可以根據(jù)最初細(xì)胞的使用數(shù)量，然后另外取一定數(shù)量的細(xì)胞裂解后測(cè)定蛋白濃度，從而計(jì)算出細(xì)胞樣品的蛋白量，最后計(jì)算出每毫克蛋白中總谷胱甘肽的含量。

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