產品簡介：
 谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(Cellular Glutathione Peroxidase Assay Kit)是一種簡單易行的通過紫外比色來檢測細胞、組織或其它樣品中谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase)活性的試劑盒。絕大部分細胞內的谷胱甘肽過氧化物酶都是含硒的，且硒為該酶的活性中性組成部分。細胞內也有很少量的不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶存在。本試劑盒檢測的是最常見的含硒的谷胱甘肽過氧化物酶。
 本試劑盒如果和總谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(S0058)配合使用，可以定量檢測出樣品中不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶。
 谷胱甘肽過氧化物酶可以清除活細胞內過氧化物，在保護細胞免受自由基損傷過程中起著關鍵作用。細胞內的脂類容易和自由基發生反應，產生脂類過氧化物。谷胱甘肽過氧化物酶可以利用還原型谷胱甘肽(GSH)還原脂類過氧化物，從而消除自由基的毒害作用。
 谷胱甘肽過氧化物酶幾乎在所有組織中都有分布。在一些病理狀況下谷胱甘肽過氧化物酶的活力會發生明顯上調或下調。
 谷胱甘肽過氧化物酶可以利用還原型谷胱甘肽(GSH)催化過氧化氫以及許多有機過氧化物，產生水或有機醇。如果以過氧化氫為底物進行檢測，則同樣可以分解過氧化氫的過氧化氫酶(Catalase)的酶活性會干擾谷胱甘肽過氧化物酶的測定。本試劑盒利用了一種間接測定的方法。谷胱甘肽過氧化物酶可以催化GSH產生GSSG，而谷胱甘肽還原酶可以利用NADPH催化GSSG產生GSH，通過檢測NADPH的減少量就可以計算出谷胱甘肽過氧化物酶的活力水平。在上述反應中，谷胱甘肽過氧化物酶是整個反應體系的限速步驟，因此NADPH的減少量和谷胱甘肽過氧化物酶的活力線性相關。
 本試劑盒利用了如下的反應原理，GPx為谷胱甘肽過氧化物酶，GR為谷胱甘肽還原酶，R-OOH為過氧化物。



 本試劑盒提供的有機過氧化物試劑(t-Bu-OOH)在沒有谷胱甘肽過氧化物酶存在的情況下不會和GSH產生反應，也不會被細胞內的過氧化氫酶催化而分解。因而可以較為特異地檢測出谷胱甘肽過氧化物酶的活力。
 由于t-Bu-OOH不能被不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶所催化，所以本試劑盒可以比較特異地定量檢測最常見的含硒的谷胱甘肽過氧化物酶。
 可檢測組織勻漿產物、細胞裂解產物等樣品中谷胱甘肽過氧化物酶的活性。一個試劑盒可進行100次檢測。
包裝清單：
產品編號 產品名稱 包裝
S0056-1 樣品勻漿液 100ml
S0056-2 谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液 50ml
S0056-3 谷胱甘肽還原酶 40微升
S0056-4 NADPH 5mg
S0056-5 還原型谷胱甘肽(GSH) 14mg
S0056-6 過氧化物試劑(t-Bu-OOH) 200微升
— 說明書 1 份
保存條件：
谷胱甘肽還原酶4℃保存，其余-20℃保存，半年有效。NADPH溶解后宜-70℃保存，4℃可以保存一天，-20℃保存一周后NADPH會減少10%以上。GSH在配制成溶液后，適當分裝，-20℃保存。
注意事項：
 本試劑盒檢測時牽涉到氧化還原反應，所有氧化劑或還原劑都會干擾本試劑盒的測定。如果在樣品中的還原劑無法避免，例如DTT、巰基乙醇等，則這些還原劑的總濃度至少低于0.1mM。0.15mM的DTT可以抑制40%的酶活力。
 常用的Triton X-100、Tween 20等去垢劑都含有較高水平的過氧化物，會影響本試劑盒的測定。如果必須使用這些去垢劑，最好使用純度較高并注明含較低過氧化物的去垢劑。
 為消除樣品中可能含有的可以消耗NADPH的酶的干擾，可以檢測不加過氧化物試劑的樣品作為對照。
 樣品可以立即測定，也可以-70℃凍存待以后測定。
 一定要嚴格控制反應時的溫度，否則會引起較多誤差。
 NADPH不太穩定，要嚴格按照后續說明操作，謹防失活。
 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 樣品的準備：
a. 細胞樣品的準備。對于貼壁細胞，由于后續用于酶活性的測定，避免使用胰酶消化細胞。可以使用EDTA處理細胞或用細胞刮子收集細胞。細胞用PBS或生理鹽水洗滌一遍。可以用碧云天生產的Western及IP細胞裂解液(P0013)參考相應的說明裂解細胞樣品。按照每100萬細胞加入100-200微升勻漿液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。4℃，12000g離心10分鐘。取上清用于酶活性的測定。
b. 組織樣品的準備。動物用含有0.16mg/ml heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 0.16mg/ml heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照約每20mg組織加入200微升勻漿液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。4℃，12000g離心10分鐘。取上清用于酶活性的測定。
c. 紅細胞裂解液的準備。用抗凝管收集血液，顛倒混勻。取至少500微升全血4℃ 2500g離心5分鐘。棄上清，用冰冷的約紅細胞沉淀10倍體積的勻漿液重懸沉淀，再同前離心，棄上清。加入約紅細胞沉淀4倍體積的冰冷的MilliQ級純水裂解紅細胞。12000g離心5分鐘，取上清。
d. 上述各種樣品可以用碧云天生產的BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012)測定蛋白濃度。通常可以先取含20-100微克蛋白的樣品用于檢測。如果發現樣品中谷胱甘肽過氧化物酶的活力過高，可以用谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液進行稀釋。如果樣品中谷胱甘肽過氧化物酶的活力過低，則需適當加大蛋白用量。準備好的樣品如果當日測定，可以在冰浴保存，如果日后測定可以-70℃凍存。
2. 試劑盒的準備工作：
a. 配制10mM NADPH。取2.5mg NADPH，加入300微升MilliQ級純水或重蒸水，溶解，混勻。預計多余的NADPH需立即分裝，-70℃保存。
b. 84mM GSH溶液的配制。在14mg GSH中加入550微升 MilliQ級純水，溶解并混勻。或稱取少量GSH，配制少量84mM GSH溶液。預計多余的GSH需立即分裝，-20℃保存。
c. GPx檢測工作液的配制。根據待測定的樣品數(含對照)，參考下表配制適當量的GPx檢測工作液。配制好的GPx檢測工作液僅限當日使用，且需盡量在冰浴上存放。
可測定樣品數(含對照) 1個樣品 10個樣品 20個樣品
10mM NADPH 5 μl 50 μl 100 μl
84mM GSH 5 μl 50 μl 100 μl
谷胱甘肽還原酶 0.4 μl 4 μl 8μl
GPx檢測工作液體積 10.4 μl 104 μl 208μl
d. 15mM過氧化物試劑溶液的配制。取21.5微升過氧化物試劑(t-Bu-OOH)加入10毫升MilliQ級純水，混勻，即配制成15mM過氧化物試劑溶液。配制好的15mM過氧化物試劑溶液僅限當日使用，且需盡量在冰浴上存放。
e. 所有試劑使用前須在水浴中或PCR儀等設備上溫育到25℃。
3. 樣品測定：
表1
空白對照 (blank) 樣品本底對照 樣品 (sample)
谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液 186 μl 180-188 μl 176-184 μl
待測樣品 － 2-10 μl 2-10 μl
GPx檢測工作液 10 μl 10 μl 10 μl
15mM過氧化物試劑溶液 4 μl － 4 μl
總體積 200 μl 200 μl 200 μl
a. 參考表1，依次加入檢測緩沖液、待測樣品和GPx檢測工作液，混勻。加入4微升15mM過氧化物試劑溶液后，反應開始。需適當混勻，可以使用培養板振蕩器。
b. 使用適當的酶標儀或微量紫外分光光度計測定A340。如果儀器可以設置溫度，把溫度設置在25℃，否則可以通過空調調節室溫到25℃，待預計儀器也達到25℃后再開始測定A340。
c. 連續測定3分鐘或自動每隔30秒測定一次A340。如果儀器不具備相應功能，可以手工操作，每隔30秒記錄A340值，至少連續記錄3分鐘，獲得6個點的數據。前15秒的數據由于反應體系需要混合等原因，數據可能不太準確，需棄掉。
d. 第一次測定時建議做1-2個樣品本底對照，如果樣品本底對照和空白對照非常接近，則說明樣品中不存在干擾物質，后續檢測類似樣品時，可以不再檢測樣品本底對照。如果樣品本底對照和空白對照有顯著差異，則每個樣品在測定時多需做樣品本底對照。計算時每個樣品的A340/min都需要扣除相應的樣品本底對照測定出來的A340/min。
e. 測定出來的A340/min最好能控制在0.03-0.15范圍內。如測定出來的A340/min數值過大，則可以把樣品適當稀釋，如A340/min數值過小，處理樣品時需設法盡量濃縮樣品。
4. 樣品中谷胱甘肽過氧化物酶酶活力的計算：
a. 谷胱甘肽過氧化物酶酶活力單位的定義：1個酶活力單位(1 unit)在25℃，pH8.0，在GSH、谷胱甘肽還原酶、t-Bu-OOH存在的條件下，在1分鐘內可以催化1微摩爾NADPH轉變成NADP+。1 U=1000 mU。
b. 對于谷胱甘肽過氧化物酶溶液：1mU/ml＝1nmol NADPH/min/ml＝(A340/min)/0.00622
即相當于：[檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力]=[A340/min(sapmle)－A340/min(blank)]/0.00622
注：[檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力]的單位為mU/ml。
c. [樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活力]＝[檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力] X[稀釋倍數]/[樣品中的蛋白濃度]
[樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活力]的單位為：U/mg蛋白或mU/mg蛋白；
[樣品中的蛋白濃度]的單位為：mg/ml。
d. 計算示例：樣品的蛋白濃度經測定為0.5mg/ml，用樣品稀釋液稀釋2倍后，取10微升稀釋后的樣品參考表1進行測定。如果A340/min(sapmle)＝0.065，A340/min(blank)＝0.003，那么
[檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力]= (0.065-0.003)/0.00622=10mU/ml
[樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活力]= 10mU/mlX2X20/(0.5mg/ml)=800mU/mg(蛋白)

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