慢病毒載體熒光蛋白-熒光素酶雙標記試劑盒

HIV-1病毒為正鏈RNA病毒，基于HIV-1病毒改造來的慢病毒載體（Lentiviral vector）系統，能有效感染非分裂細胞和分裂細胞，將載體中所攜帶的目的基因整合到宿主細胞基因組中，使之隨細胞基因組的分裂而分裂，目的基因能實現長期穩定的表達。除腫瘤細胞外，大量文獻研究表明，慢病毒載體能夠感染那些其它載體難以轉染的細胞，如神經元細胞、淋巴細胞、心肌細胞、內皮細胞、干細胞或其它原代細胞，能介導所包含的目的基因在腦、肝臟、肌肉、視網膜、造血干細胞、骨髓間充質干細胞、巨噬細胞等組織或細胞中長期表達。因此，人們常用慢病毒載體將熒光素酶基因或其它目的基因導入實驗動物、原代細胞或腫瘤細胞系。

本公司自行研發的專門標記干細胞的GFP/mCherry-熒光素酶雙報告慢病毒載體包裝試劑盒，將慢病毒載體包裝過程中的難點和關鍵點，如載體構建和瞬時轉染等步驟進行了簡化和優化，并濃縮成簡單的試劑盒，方便了操作，也提高了效率。高效的包裝系統，優化的轉染技術，最專業的技術支持，努力使您能方便地應用慢病毒載體技術為活體成像的應用提供支撐。

這一系統的目的，主要是為了解決以下問題：
● 用GFP/mCherry-熒光素酶基因雙報告慢病毒系統穩定感染各種細胞，能大大提高熒光蛋白和熒光素酶基因的表達效率。

●提供方便的雙標記系統，擴大了活體成像技術在干細胞和腫瘤等方面的研究和應用。

優勢：

• 高效的感染：包裝的病毒系統可侵染最多的細胞類型，包括非分化細胞和難以轉染細胞（原代、血、干細胞）。
• 表達穩定，可遺傳：包裝基因整合到基因組DNA上，高水平表達，低變異。
• 不干擾細胞：細胞功能不受侵染過程影響。
• 生物安全：三質粒系統包裝最大的安全性；非人源HIV 病毒最大限度降低風險。
• 高包裝效率：病毒包裝時采用的轉染試劑提供系統質粒轉染效率接近100%。
• 完整的病毒包裝體系：提供載體構建、轉染、病毒濃縮和純化、滴度檢測等病毒包裝產品。最大程度的降低包裝繁瑣程度，提供包裝病毒產品。 此外，本系統同時表達熒光蛋白和熒光素酶雙報告基因，即可通過熒光顯微鏡直接觀察感染效率，也可通過流式細胞術直接分選感染細胞，可方便的通過活體成像儀跟蹤細胞在體內的生長情況，為干細胞和腫瘤等研究提供了便捷的體外觀察和活體成像工具。

本公司熒光素酶慢病毒載體包裝試劑盒由二部分組成：

    1. 慢病毒上清液400μl，病毒滴度6×107

2. 轉染試劑protamin（1000×，10ul）

篩選標記：Hygromycin

實驗過程：

慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。本試劑盒包括了所有的轉錄并包裝目的基因到重組的慢病毒載體所需要的所有輔助蛋白。您可以將慢病毒上清液直接用于干細胞的感染，熒光素酶基因進入到干細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達熒光素酶等效應分子。

常見問題解答:

常見問題解答:

1.  我們用的包裝系統效率遠高于Invitrogen的系統，具體圖譜沒有電子版本，基本結構差不多，但比Invitrogen的多了cPPT和WPRE，因此包裝效率高了很多。

2.  質粒混合物有三種載體組成，其中包括一個熒光素酶表達載體，另兩個是慢病毒包裝載體，三種載體共轉染293T細胞后，在細胞中重組為慢病毒，并分泌至培養上清中，一般滴度在5×106左右。病毒可以濃縮，我們可提供專用的病毒濃縮液，但要想達到1010的話，則需要包裝100盤10cm左右的細胞然后濃縮，工作量和花費都很巨大。

3.  轉染效率，對于人類腫瘤細胞來說是90%左右，整合到基因組里穩定表達的幾率是10%左右；對于一般方法很難轉染的鼠源性的腫瘤細胞的轉染效率是50%左右。

4.  100μl病毒上清液的病毒滴度是5×106—1×107之間。

5.  50μl的病毒上清液可用12孔板或24孔板轉染，12孔板每孔可放的細胞量是5×105，24孔板每孔可放的細胞量是1×105每孔需要加入的病毒上清液是20-30μl，100μl最多可加5個孔。

6.  包裝好的病毒上清液最好在3天之內轉染細胞，建議不反復凍存。否則在一凍一溶的過程中，病毒滴度會降低一半，病毒活性也會降低。

7.  在轉染細胞前，換用無血清培養基，加入轉染試劑protamin（2000×,1ml培養基加0.5ul）,搖勻，轉染6-8小時換有血清培養基。

8.  細胞的篩選：轉染后的48-72小時加入篩選藥物Hygromycin（100ug/ul）,每毫升培養基加3-5ul, 24h換液。細胞對潮霉素的反應比較敏感，一般處理24小時后撤藥，細胞狀態恢復后再做同樣處理，根據需要處理2-3次即可，切不可持續給藥！否則細胞會全部死亡。潮霉素一般用潮霉素B，沒有廠家區別，質量一般都有保證。以后細胞逐漸由24孔板傳至12孔板、6孔板、6cm盤、10cm盤中培養。

9.  細胞的鑒定：取5×104細胞鋪入24孔板，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。

10.  轉染干細胞的MOI值建議梯度為50倍、75倍、100倍。按照MOI值100計算的話，2×107病毒量可轉染的細胞數是20萬個細胞。使用24孔板，每孔1萬個細胞的話，可以轉20個孔。

11.  本試劑盒具有很高的轉染效率，在95%以上。對于干細胞，可以選擇不加Hygromycin篩選，通過熒光蛋白進行流式檢測和分選。在實驗過程中發現，很難掌握合適的Hygromycin篩選壓力，造成實驗的麻煩。如果因實驗需要，必須加Hygromycin篩選，建議先用未標記的干細胞進行耐受劑量的摸索，切勿直接用標記過的干細胞進行劑量摸索，免得損失標記過的干細胞。

12.  絕大多數細胞感染慢病毒后生長特性不變，也有少數細胞經病毒轉染后增殖變慢，可考慮重新感染建系。