產品簡介：
 DAF-FM DA即3-Amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetate，也稱DAF-FM diacetate或4-Amino,5-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetate。DAF-FM DA是最新一代用于一氧化氮定量檢測的熒光探針，比以前比較常用的一氧化氮熒光檢測探針DAF-2 diacetate有多方面的改進。首先，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，最后和一氧化氮反應形成的熒光產物受pH值的影響小，在pH值大于5.5時不受pH值的影響。其次，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，前者產生的熒光更加穩定，不容易淬滅，這樣更加便于檢測。另外，DAF-FM DA和DAF-2 diacetate相比，前者對一氧化氮的檢測靈敏度更高，相同條件下檢測靈敏度可以提高接近2倍，最低檢測濃度可以達到3nM。







 DAF-FM DA可以穿過細胞膜(cell-permeable)，進入細胞后可以被細胞內的酯酶催化形成不能穿過細胞膜的DAF-FM 。DAF-FM本身僅有很弱的熒光，但在和一氧化氮反應后可以產生強烈熒光，激發波長為495nm，發射波長為515nm。DAF-FM DA檢測一氧化氮的機制可以參考上圖。任何可以檢測fluorescein的儀器，包括熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、熒光分光光度計或熒光酶標儀都可以用于該熒光探針的檢測。右圖為DAF-FM在不同濃度一氧化氮存在時的發射熒光掃描圖譜(fluorescence emission spectra)。
 DAF-FM DA的分子量為496.4，分子式為C25H18F2N2O7，HPLC分析純度大于98%。
 本DAF-FM DA為溶解于DMSO的淡黃色溶液，濃度為5mM。
 本熒光探針適合于檢測細胞內的一氧化氮水平，可以進行實時檢測。如果收集細胞后再裝載探針，通常至少可以檢測100個樣品。
包裝清單：
產品編號 產品名稱 包裝
S0019-1 DAF-FM DA (NO熒光探針) 5mM 20微升
S0019-2 DAF-FM DA稀釋液 50ml
— 說明書 1 份
保存條件：
-20℃保存，DAF-FM DA需避光保存，一年有效。
注意事項：
 BSA和酚紅(phenol red)對本熒光探針的檢測有干擾，需避免。
 第一次使用時請分裝成小包裝后-20℃保存，以避免反復凍融。
 熒光探針應隨用隨配。配制好的探針工作液應立即使用，不能以后再用。
 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 裝載探針
對于刺激時間較短(通常為2小時以內)的細胞，先裝載探針，后用適當的陽性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細胞，先用適當的陽性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養細胞。按照1:1000比例，用本試劑盒提供的DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA，使終濃度為5微摩爾/升。去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DAF-FM DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DAF-FM DA的體積為1毫升。37℃細胞培養箱內孵育20分鐘。用PBS(pH7.4)洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DAF-FM DA。
收集細胞后裝載探針：按照1:1000比例，用本試劑盒提供的DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA，使終濃度為5微摩爾/升。細胞收集后，用稀釋好的DAF-FM DA重懸細胞，細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細胞培養箱內孵育20分鐘。上述操作可以在離心管內進行。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用PBS(pH7.4)洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DAF-FM DA。直接用適當的陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后再刺激細胞。
2. 檢測
對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察(用普通的熒光顯微鏡觀察效果相對較差)，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。
3. 參數設置
使用495nm激發波長，515nm發射波長，實時、逐時間點或單時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DAF-FM和一氧化氮反應產物的熒光光譜和fluorescein非常相似，可以用檢測fluorescein的參數設置進行檢測，用檢測FITC的參數設置進行檢測也可以。
4. 其它說明
上述推薦的DAF-FM DA的工作濃度為5微摩爾/升，對于某些細胞，如果發現沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000-1:5000的比例稀釋DAF-FM DA，使裝載探針時DAF-FM DA的濃度為1-2.5微摩爾/升。相反，如果發現用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可以把DAF-FM DA的工作濃度為調整為10微摩爾/升，以提高檢測的靈敏度。另外，探針裝載的時間也可以根據情況在15-60分鐘內適當進行調整。

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