產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Ø GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒(GSH and GSSG Assay Kit)是一種簡(jiǎn)單易行的可以分別檢測(cè)出GSH(還原型谷胱甘肽)和GSSG(氧化型谷胱

甘肽)含量的檢測(cè)試劑盒。
Ø 通過(guò)谷胱甘肽還原酶把GSSG還原成GSH，而GSH可以和生色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB和GSSG。適當(dāng)配制反應(yīng)體系，前后兩個(gè)反

應(yīng)合并起來(lái)后，總谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相當(dāng)于一個(gè)顏色產(chǎn)生的限速因素，總谷胱甘肽的量就決定了黃色的TNB形成量。從而通
過(guò)測(cè)定A412就可以計(jì)算出總谷胱甘肽的量。用適當(dāng)試劑先清除樣品中的GSH，然后利用上述反應(yīng)原理就可以測(cè)定出GSSG的含量。
用總谷胱甘肽(GSSG+GSH)的量扣除GSSG的含量，就可以計(jì)算出GSH的含量。
Ø 本試劑盒的具體反應(yīng)原理如下：



兩個(gè)反應(yīng)相合并：

Ø 還原型谷胱甘肽是絕大多數(shù)活細(xì)胞中巰基的主要來(lái)源，對(duì)于維護(hù)蛋白巰基適當(dāng)?shù)难趸�還原狀態(tài)有重要作用，并且是動(dòng)物細(xì)胞中關(guān)

鍵的抗氧化劑�？偣入赘孰闹型ǔ�90-95%為還原型谷胱甘肽。
Ø 本試劑盒可以檢測(cè)動(dòng)物組織、血漿、紅細(xì)胞、和培養(yǎng)細(xì)胞或其它適當(dāng)樣品中GSH和GSSG的含量。

Ø 本試劑盒提供了蛋白去除試劑M，可以更加準(zhǔn)確地測(cè)定出含有蛋白的樣品中的GSH和GSSG的量。

Ø 本試劑盒的檢測(cè)下限為0.5微摩爾/升。一個(gè)試劑盒共可以進(jìn)行100次檢測(cè)，可以測(cè)定100個(gè)樣品的總谷胱甘肽或GSSG的含量，或
可以測(cè)定出50個(gè)樣品中GSH和GSSG的各自含量。




包裝清單：

產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品名稱(chēng) 包裝
S0053-1 總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液 60ml
S0053-2 谷胱甘肽還原酶 12微升
S0053-3 氧化型谷胱甘肽(GSSG) 5mg
S0053-4 DTNB 4.5mg
S0053-5 蛋白去除試劑M 1g
S0053-6 NADPH 4mg
S0053-7 DMSO 1.5ml
S0053-8 GSH清除輔助液 0.8ml
S0053-9 GSH清除試劑 160微升
— 說(shuō)明書(shū) 1份




保存條件：

NADPH和GSH清除試劑-20℃保存，其余4℃保存，半年有效。GSSG配制成溶液后，需適當(dāng)分裝，-20℃保存至少3個(gè)月有效。DTNB

溶解于DMSO后需適當(dāng)分裝，-20℃保存至少3個(gè)月有效。蛋白去除試劑M配制成溶液后僅限當(dāng)天使用。NADPH溶解后，適當(dāng)分裝，-70℃
保存。稀釋的GSH清除輔助液和GSH清除試劑溶液均須新鮮配制使用。



注意事項(xiàng)：

Ø 本試劑盒檢測(cè)時(shí)牽涉到氧化還原反應(yīng)，所有氧化劑或還原劑都會(huì)干擾本試劑盒的測(cè)定。特別是DTT、巰基乙醇等含有巰基的試劑

會(huì)嚴(yán)重干擾本試劑盒的測(cè)定，請(qǐng)盡量避免。
Ø 一定要嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)的溫度和反應(yīng)時(shí)間，否則需每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。


Ø NADPH等試劑不太穩(wěn)定，要嚴(yán)格按照后續(xù)說(shuō)明操作，謹(jǐn)防失活。


Ø 蛋白去除試劑M溶液必須新鮮配制并限當(dāng)日使用。GSH清除試劑也須新鮮稀釋后使用。

Ø 所需Milli-Q級(jí)純水可以向碧云天訂購(gòu)。

Ø 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。


使用說(shuō)明：

1. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：

a.
GSSG儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的5mg GSSG中加入816微升Milli-Q級(jí)純水，溶解并混勻，即為GSSG儲(chǔ)備液，濃度為10mM。


除立即待用部分外，其余GSSG儲(chǔ)備液適當(dāng)分裝后-20℃保存。

b. DTNB儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的4.5mg DTNB中加入1.5毫升本試劑盒提供的DMSO，溶解并混勻，即為DTNB儲(chǔ)備液。除立

即待用部分外，其余DTNB儲(chǔ)備液適當(dāng)分裝后-20℃保存。
c. 蛋白去除試劑M溶液的配制：稱(chēng)取0.2克蛋白去除試劑M，加入4毫升總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液，配制成4毫升5%的水溶液。蛋白去除

試劑M溶液必須新鮮配制并限當(dāng)天使用。
d. NADPH儲(chǔ)備液的配制：在本試劑盒提供的4mgNADPH中加入100微升Milli-Q級(jí)純水，溶解并混勻，即為NADPH儲(chǔ)備液。除立即待用

部分外，其余NADPH儲(chǔ)備液適當(dāng)分裝后-70℃保存。
e. 40倍稀釋谷胱甘肽還原酶的配制：取1微升谷胱甘肽還原酶，加入39微升總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液，混勻，即成40倍稀釋的谷胱甘

肽還原酶。
f. 總谷胱甘肽檢測(cè)工作液的配制：根據(jù)待檢測(cè)的樣品數(shù)參考下表配制適當(dāng)量的總谷胱甘肽檢測(cè)工作液，表中三種試劑按比例混合后

即為總谷胱甘肽檢測(cè)工作液。
/ 1個(gè)樣品 10個(gè)樣品 20個(gè)樣品
40倍稀釋谷胱甘肽還原酶 4.3微升 43微升 86微升
DTNB儲(chǔ)備液 2.2微升 22微升 44微升
總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液 150微升 1.5毫升 3毫升

g. 0.16mg/mlNADPH的配制：取2微升NADPH儲(chǔ)備液，加入500微升總谷胱甘肽檢測(cè)緩沖液，混勻即為0.16mg/mlNADPH。每檢測(cè)一個(gè)
樣品需50微升0.16mg/ml NADPH。
h. 稀釋的GSH清除輔助液的配制：在47微升Milli-Q級(jí)純水中加入53微升GSH清除輔助液，立即混勻。稀釋后的GSH清除輔助液不太
穩(wěn)定，每次使用時(shí)均須新鮮配制，并僅限當(dāng)日使用。
i. GSH清除試劑工作液的配制：10.8微升GSH清除試劑中加入89.2微升無(wú)水乙醇，立即混勻。GSH清除劑工作液每次也須新鮮配制。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：

a. 把10mM GSSG儲(chǔ)備液用蛋白去除試劑M溶液稀釋成15μM GSSG溶液。再依次稀釋成10、5、2、1、0.5μM GSSG溶液。取15、10、

5、2、1、0.5μM GSSG溶液六個(gè)點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：由于GSSG在蛋白去除試劑M溶液中不太穩(wěn)定，用蛋白去除試劑M溶液配制
的GSSG溶液必須新鮮配制后使用，不可凍存后再使用。
b. 如果需要測(cè)定樣品中GSSG含量，按照每100微升標(biāo)準(zhǔn)品加入5微升稀釋的GSH清除輔助液的比例加入稀釋的GSH清除輔助液，立即

vortex混勻。然后按照每100微升加入1微升GSH清除試劑工作液的比例加入GSH清除試劑工作液，立即vortex混勻，25℃反應(yīng)
60分鐘。即可用于后續(xù)的GSSG含量的檢測(cè)。
3. 待測(cè)總谷胱甘肽含量樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：
a. 組織樣品的準(zhǔn)備。取組織用液氮速凍，然后研成粉末。每10毫克研碎的組織粉末，加入30微升蛋白去除試劑M溶液，然后充分

Vortex。再加入70微升蛋白去除試劑M溶液，用玻璃勻漿器充分勻漿(對(duì)于比較容易勻漿的組織可以不用液氮速凍等處理，而直
接加入適量蛋白去除試劑M溶液進(jìn)行勻漿)。4℃放置10分鐘后，10,000g 4℃離心10分鐘，取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。樣品
需暫時(shí)4℃保存，不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過(guò)10天。對(duì)于處理好的組織樣品通常需進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)
定，稀釋倍數(shù)通常為5-20倍。
b. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備。請(qǐng)盡量使用新鮮的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，而不要使用凍存的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。PBS洗滌細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞，吸盡

上清。加入細(xì)胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑M溶液，即如果細(xì)胞沉淀為10微升，則加入30微升蛋白去除試劑M溶液，然后充分
Vortex。(細(xì)胞沉淀的體積可以根據(jù)細(xì)胞沉淀的重量進(jìn)行估算。收集細(xì)胞前后分別對(duì)離心管進(jìn)行稱(chēng)重，從而就可以計(jì)算出細(xì)胞沉
淀的重量。10毫克細(xì)胞沉淀的體積可以粗略地看做10微升。) 然后利用液氮和37℃水浴對(duì)樣品進(jìn)行兩次快速的凍融。4℃或冰浴
放置5分鐘。4℃，10,000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。樣品需暫時(shí)4℃保存，如不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保
存，但不宜超過(guò)10天。對(duì)于處理好的細(xì)胞樣品通常需進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，稀釋倍數(shù)可以高達(dá)20倍。
c. 紅細(xì)胞或血漿樣品的準(zhǔn)備。請(qǐng)盡量使用新鮮的血液進(jìn)行測(cè)定。600g離心10分鐘，沉淀為紅細(xì)胞，上清為血漿。對(duì)于紅細(xì)胞，用

PBS洗滌兩次。取約50微升紅細(xì)胞沉淀或血漿，加入50微升蛋白去除試劑M溶液，充分Vortex。4℃或冰浴放置10分鐘。4℃，
10,000g離心10分鐘。取上清用于總谷胱甘肽的測(cè)定。樣品需暫時(shí)4℃保存，如不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過(guò)
10天。對(duì)于處理好的紅細(xì)胞樣品最后需稀釋10倍后再進(jìn)行后續(xù)的測(cè)定，而對(duì)于血漿樣品，應(yīng)直接取10微升進(jìn)行測(cè)定。
d. 說(shuō)明：對(duì)于一些谷胱甘肽含量特別低的樣品，可以通過(guò)冷凍干燥進(jìn)行濃縮后再進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于濃度過(guò)高需要稀釋的樣品，宜用蛋
白去除試劑M溶液進(jìn)行稀釋。
4. 待測(cè)GSSG含量樣品的準(zhǔn)備：

取部分上述準(zhǔn)備好的待測(cè)總谷胱甘肽含量的樣品，按照每100微升樣品加入5微升稀釋的GSH清除輔助液的比例加入稀釋的GSH清除
輔助液，立即vortex混勻。再按照每100微升樣品加入1微升GSH清除試劑工作液的比例加入GSH清除工作液，立即vortex混勻，
25℃反應(yīng)60分鐘。通過(guò)上述反應(yīng)可以清除高達(dá)1mM的GSH，如果樣品中GSH含量過(guò)高需進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行去除GSH的操作。通
過(guò)上述處理就可以用于后續(xù)的測(cè)定。

5. 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定：
a. 參考表1，使用96孔板，依次加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。加入150微升總谷胱甘肽檢測(cè)工作液后，混勻，25℃或室溫孵育5分鐘。

表1

/ 空白對(duì)照(blank) 標(biāo)準(zhǔn)曲線(standard) 樣品(sample)
樣品或標(biāo)準(zhǔn)品 0微升 10微升 x微升
蛋白去除試劑M溶液 10微升 0微升 10-x微升
總谷胱甘肽檢測(cè)工作液 150微升 150微升 150微升
25℃或室溫孵育 5分鐘 5分鐘 5分鐘
0.16mg/ml NADPH 50微升 50微升 50微升

b. 加入50微升0.16mg/ml NADPH溶液，混勻。

c. 立即用酶標(biāo)儀測(cè)定A412，每5分鐘測(cè)定一次或?qū)崟r(shí)測(cè)定，共測(cè)定25分鐘，測(cè)得5個(gè)數(shù)據(jù)。(說(shuō)明：為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，可以在加入

NADPH溶液混勻后25分鐘，僅測(cè)定一次A412)。如果儀器可以設(shè)置溫度，把溫度設(shè)置在25℃，否則就在室溫狀況下測(cè)定。如果酶標(biāo)
儀不能測(cè)定A412，可以測(cè)定405-414nm附近范圍的吸光度。
d. 注意：如果進(jìn)行GSSG含量測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)品也須平行地進(jìn)行去除GSH的相關(guān)操作，以減小誤差。如果樣品需同時(shí)測(cè)定總谷胱甘肽含量
和GSSG含量，由于兩者的檢測(cè)體系不同，須分別單獨(dú)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6. 樣品中總谷胱甘肽含量的計(jì)算：
a. 單點(diǎn)測(cè)定法：即反應(yīng)25分鐘后僅測(cè)定一次吸光度。根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的不同吸光度作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即

可計(jì)算出總谷胱甘肽或GSSG的含量。實(shí)際計(jì)算出來(lái)的總谷胱甘肽的含量相當(dāng)于把氧化型谷胱甘肽的含量乘以2再加上還原型谷胱
甘肽的含量。單點(diǎn)法測(cè)定相對(duì)比較便捷，而動(dòng)力學(xué)法測(cè)定則相對(duì)比較精確。注意：GSSG的濃度如果換算成GSH的濃度需乘以2，
例如GSSG的濃度為5μM，則相當(dāng)于GSH的濃度為10μM。
b. 動(dòng)力學(xué)測(cè)定法：先根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定得到的吸光度值計(jì)算出ΔA412/min。然后以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以ΔA412/min為縱坐

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