技術(shù)簡(jiǎn)介

用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過(guò)Western Blot檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用，質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白鑒定蛋白質(zhì)類型。

圖注：云序RNA pull-down實(shí)驗(yàn)流程

云序優(yōu)勢(shì)：

低豐度富集：

富集檢測(cè)低豐度目的蛋白-RNA復(fù)合物

具有成熟蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)：

提供RNApull-down 產(chǎn)物WesternBlot及質(zhì)譜鑒定。

專業(yè)的生信信息分析：

提供SCI發(fā)表級(jí)別的圖表。

樣本要求：

樣品類型

細(xì)胞、組織或IP后的RNA，其它樣品信息請(qǐng)?jiān)斣?/p>

樣品量

a）細(xì)胞：5×10⁸

b）組織：500mg

c）IP后的RNA >1μg

樣品運(yùn)輸與保存

樣品運(yùn)輸：樣品置于1.5mL Eppendorf管中，封口膜封好，干冰運(yùn)輸。

樣品保存：細(xì)胞樣品或新鮮組織塊可用TRIZOL或RNA保護(hù)劑處理，液氮凍存后-80℃保存；RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

案例解析：

案例 1  RNA pull-down檢測(cè)lncRNA與蛋白質(zhì)相互作用 

近年來(lái)，大量的研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）與多種癌癥的發(fā)生息息相關(guān)，這篇文章中作者研究了在非小細(xì)胞肺癌（NSCLCs）中起重要調(diào)控作用的lncRNA-linc00630。作者通過(guò)RNA pull-down等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，linc00630主要通過(guò)結(jié)合組蛋白去乙酰化酶I（HDAC1）以及DEAD-box解旋酶23（DDX23）來(lái)發(fā)揮其功能機(jī)制。

圖注：長(zhǎng)鏈非編碼RNA-Linc00630表達(dá)驗(yàn)證及功能表征

案例2  RNA pull-down檢測(cè)circRNA與蛋白質(zhì)相互作用

環(huán)狀RNA是近年來(lái)受到廣泛關(guān)注一類非編碼RNA，目前主要認(rèn)為環(huán)狀RNA通過(guò)miRNA海綿機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)，但是對(duì)于其更全面的分子功能知之甚少。這篇文章中作者發(fā)現(xiàn)在不同癌細(xì)胞中circ-Foxo3持續(xù)少量表達(dá)，而在癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，circ-Foxo3表達(dá)量顯著性增加。circ-Foxo3可以促進(jìn)MDM2介導(dǎo)p53進(jìn)入泛素化途徑降解，使p53含量下降，同時(shí)circ-Foxo3又可以通過(guò)阻止MDM2介導(dǎo)Foxo3泛素化而提高Foxo3的表達(dá)量。

圖注：circ-Foxo3癌細(xì)胞中表達(dá)情況

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