TAP-MS串聯親和純化質譜實驗原理

 

過表達TST-Flag雙標簽融合蛋白的細胞，經裂解后先與Streptactin珠子孵育、初次洗滌及洗脫，釋放出蛋白復合物；再將此蛋白復合物與anti-Flag珠子結合、再次洗滌，最后的洗脫產物用質譜鑒定未知的互作蛋白。

 

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TAP-MS串聯親和純化質譜實驗流程

 

 

 

 

應用領域

 

 

 

 

 

 

TAP MS應用背景

 

隨著確定細胞內蛋白質的相互作用成為當今生命科學的研究熱點，雙雜交技術已經廣泛應用于研究蛋白—蛋白間的相互作用，但由于其篩選步驟復雜，假陽性結果較多，難于量化，故不能滿足大規模蛋白質研究的需要，因此串聯親和純化（TAP）技術以其高效、高純度、以及能夠高度模擬真實生理條件等優勢，迅速成為篩選、發現和鑒別新的相互作用蛋白質的主流技術之一。

目前，TAP技術與質譜技術的聯用，以及質譜技術的自動化，使得大規模地分析相互作用的蛋白質在技術上成為可能。

TAP技術采用兩步親和純化，提高了純化產物的特異性，具有周期短、假陽性結果少等優點。通過這種方法鑒定到的蛋白質相互作用能真實地反映出細胞中蛋白質分子之間的聯系，實驗結果更加接近真實情況，而且TAP技術還特別適用于蛋白質組水平上的大規模研究。

 

 

 

 

TAP-MS實驗研究案例—客戶文章解析

 

 

 

鳥嘌呤核苷酸交換因子的差異rac1信號涉及FLII在調節rac1驅動的細胞遷移中的作用

 

研究背景

 

小的GTP酶 rac1與腫瘤的形成和擴散有關。當被鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)激活時，rac1與細胞中的各種蛋白質結合，從而調節各種功能，包括細胞遷移。然而，當在臨床環境中以rac1為靶點時，rac1的激活可以導致相反的遷移表型，增加了加劇腫瘤進展的可能性。這就需要確定影響rac1驅動的細胞運動的因素。

 

 

研究路線

1

過表達與 pull down實驗證實Tiam1和P-Rex1誘導不同的rac1下游效應

2

通過TAP/ SILAC結合的方法檢測 Tiam1或 P-Rex1誘導后的rac1相互作用體，證實Tiam1和P-Rex1對racl互動體有不同的調控作用

3

免疫共沉淀、 GST pull down和PLA實驗結果證實FLII優先與活性racl結合FLII是一種新的富含P-RExl的rac1結合伙伴

4

結構域分析證實FLII通過不同的結構域與rac1和P-Rex1結合

5

Pull down實驗和細胞遷移實驗證實FLII是P-REx1-rac1驅動的細胞遷移所必需的

6

基因敲除實驗表明P-Rex1可以通過FLII介導特定的細胞功能，包括細胞收縮，從而促進細胞遷移

 

 

研究結論

 

研究證實P-Rex1不僅能激活rac1，而且還能將蛋白質(如FLII)定向到rac1的活性形式，以介導特定的細胞功能，包括細胞收縮，從而使P-Rex1能夠促進細胞遷移。因此，這項研究提供了對以前未報道的P-REx1-rac1介導細胞遷移的細胞功能的洞察力，并強調了P-Rex1和rac1可能驅動癌癥擴散的其他模式。

 

 

客戶文獻

 

Hadir Marei. et al: Differential Rac1 signalling by guanine nucleotideexchange factors implicates FLII in regulating Rac1-driven cell migration.Nat Communications. 2016，IF=14.919.