支原體污染的危害
支原體是實驗室中常見的污染細胞的原核生物,據統(tǒng)計約有15%-35%的細胞被支原體污染。支原體會改變宿主細胞的結構和功能等一系列特征,造成實驗結果不準確;干擾細胞代謝和生長,改變核酸合成,影響細胞抗原性,導致染色體改變,干擾病毒復制以及模仿病毒的作用。因此,每一株外來細胞在進入實驗室之前,都應進行支原體檢測,并且應對培養(yǎng)中的細胞定期(如每2-3個月)進行支原體檢測服務。
建立定期的監(jiān)控方案,有助于提高科研效率,在污染發(fā)生早期及時處理,可避免支原體污染造成更大損失!
原理
利用qPCR(TaqMan探針法)檢測支原體DNA,反應體系中同時存在標記兩種顏色TaqMan探針及相關引物,分別檢測支原體DNA和內模板。
支原體檢測優(yōu)勢
1、靈敏度:qPCR法最低的穩(wěn)定檢測至10拷貝的支原體DNA。
2、穩(wěn)定:qPCR法全程閉管操作,無產物交叉污染。
3、可靠:通過內參擴增效率的檢測,可有效檢測試劑盒質量,樣本中各類PCR抑制劑的影響,避免假陰性。
4、方便:操作簡單,無需后期跑電泳步驟。
5、定量:通過CT值判斷,可進行定量檢測。結果可分為:陰性、弱陽性、陽性、強陽性,給科研人員提供更多的有用信息。
結果判斷
PCR模板 |
支原體(FAM)CT值 |
判定說明 |
陽性對照 |
26±3 |
陽性成立 |
>30 |
陽性不成立 |
陰性對照 |
>34 |
陰性成立 |
<34 |
陰性不成立 |
待測樣品
(內參CT值<30) |
>34 |
陰性 |
30-33 |
灰區(qū),需驗證 |
25-29 |
弱陽性 |
19-24 |
陽性 |
<19 |
強陽性 |
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