摘要

應(yīng)用高分辨率熔解曲線技術(shù)進(jìn)行基因分型不僅簡(jiǎn)單而且有效。基于熔解曲線的分析方法中，探針?lè)ㄊ沁M(jìn)行基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠全面的檢測(cè)匹配的目的等位基因。小片段擴(kuò)增法是一種不需要設(shè)計(jì)探針進(jìn)行基因分型的方法。由于異源雙鏈的存在，雜合子很容易檢測(cè)，而這很大程度上改變?nèi)劢廪D(zhuǎn)化的峰形。純合子基因分型中G/C或A/T的改變是最難檢測(cè)的，因?yàn)樗鼈兊牡任换�因有相似的Tm值。那些稱為中性純合子的堿基對(duì)使用小片段法是很難區(qū)分。此外，純合子難區(qū)分也受樣品與樣品間溫度的變化，緩沖液和體積的限制。無(wú)論多么精確的儀器，相關(guān)的變化可能是顯著的，所以需要一種方法來(lái)減少這種變化并且改善小片段基因分型。而使用特異性內(nèi)標(biāo)就可以克服這些限制。

背景

人工合成的寡核苷酸內(nèi)標(biāo)和互補(bǔ)序列包含相同的分子濃度。在內(nèi)標(biāo)存在的情況下，使用普通96孔板PCR儀，并添加LC Green® Plus染料進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)完成后將PCR產(chǎn)物放入Lightsanner儀器，在55℃到97℃進(jìn)行熔解曲線分析。內(nèi)標(biāo)的溶解識(shí)別通過(guò)每個(gè)樣品的熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)。基因型通過(guò)測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)測(cè)量每個(gè)樣品組相應(yīng)的基因型的Tm值峰間的距離來(lái)估算校正前后的純合基因型檢測(cè)的錯(cuò)誤率。當(dāng)樣品的Tm值與錯(cuò)誤組的Tm值接近時(shí)，錯(cuò)誤將被檢測(cè)到。

結(jié)果

通過(guò)使用不同微孔板和PCR模板驗(yàn)證，使用溫度內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)后，純和基因型在中性單核苷酸多態(tài)性堿基對(duì)檢測(cè)的靈敏度提高了90%到99%以上。使用溫度內(nèi)標(biāo)后Tm值標(biāo)準(zhǔn)較低大約0.056到0.027℃。

結(jié)論

內(nèi)標(biāo)提高小片段內(nèi)的純和基因型G/C和T/A堿基的改變。該研究被國(guó)家衛(wèi)生部以下部分津貼支持：R44DK069106 、R44HD053215 to SFD 、 R42GM072419 和R42GM073396 to CTW。

背景

變性或熔解時(shí)，由于核酸固有特性的不同使得基因型信號(hào)會(huì)發(fā)生變化。基于探針的基因分型在相關(guān)的大量的等位基因特異性在溫度變化幾度上有較大的優(yōu)勢(shì)。高分辨率熔解曲線提供了整個(gè)雙鏈的熔解圖并且可以去掉探針。此外，每個(gè)實(shí)驗(yàn)當(dāng)整個(gè)擴(kuò)增子被監(jiān)測(cè)時(shí)，獲得的堿基審問(wèn)數(shù)量增加達(dá)20倍。由于非常相似的熔解圖和熔解溫度，使純和基因型在沒有探針的情況下檢測(cè)難度增加。小片段提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的基因分型方案。
值得注意的是，與大片段擴(kuò)增子相比小片段擴(kuò)增能夠更好的進(jìn)行純合子檢測(cè)，因?yàn)樘禺惢�因型Tm值變化將更大。但是，某些因素可以影響大量純合子的分離。從堿基類型Tm值變化到設(shè)備變化和樣品和樣品的不同都能影響基因分型。溫度內(nèi)標(biāo)可以減小這些變化，固定熔解轉(zhuǎn)變和提高基因分型的靈敏度。當(dāng)小片段引物僅僅對(duì)側(cè)翼的SNP匹配時(shí)，將會(huì)得到最好的結(jié)果。

方法

PCR反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)體系中加入1X LightScanner高靈敏度Mastermix，該Mastermix包含熱啟動(dòng)酶，鎂離子緩沖液，其它成分和核酸校準(zhǔn)，該P(yáng)CR的熔解區(qū)間大約在62C和92C。體系中包括0.10μM或0.15 μM的引物，人基因組DNA10-15 ng。PCR循環(huán)條件如下：95C預(yù)變性2min，94C/30s，64-67C/30s(根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定)包含退火和延伸，45個(gè)循環(huán)。最后的退火條件為28C/30s。所有DNA樣品的基因型通過(guò)探針?lè)�檢測(cè)。
熔解在96孔板的LightScanner設(shè)備上進(jìn)行，數(shù)據(jù)采集從55-97C。熔解后數(shù)據(jù)校準(zhǔn)首先使用接近熒光數(shù)據(jù)的平滑線條，接下來(lái)，將使用該數(shù)據(jù)的線條插值峰計(jì)算Tm值。這一調(diào)整過(guò)程可以校準(zhǔn)每個(gè)擴(kuò)增子的熔解峰，以達(dá)到最小的變化。數(shù)據(jù)重新使用LightScanner軟件進(jìn)行分析。擴(kuò)增子Tm值附近的溫度區(qū)域用于分析（有或沒有以前內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)）同時(shí)以衍生峰顯示。

結(jié)果

使用溫度內(nèi)標(biāo)前的完整熔解圖見圖1，圖中標(biāo)出了從低溫內(nèi)標(biāo)到高溫內(nèi)標(biāo)的熔解圖，中間為擴(kuò)增子的熔解圖。

圖1. 衍生的熔解曲線顯示了內(nèi)標(biāo)和擴(kuò)增子的熔解峰。內(nèi)標(biāo)的熔解峰在左右兩側(cè)。94個(gè)熔解圖產(chǎn)生于獨(dú)立的PCR反應(yīng)，熔解峰大約出現(xiàn)在76C。內(nèi)標(biāo)分子沒有校準(zhǔn)，純合子的峰沒有完全分開。中間最窄的和最高的峰是A/A(藍(lán)色)和T/T(紅色)，它是CPS1 A/T多態(tài)性的純和基因型。先前基于探針的基因分型顏色已經(jīng)增加,不是基于這個(gè)小片段熔解數(shù)據(jù)。中間的另一個(gè)峰是A/T雜合子峰。插圖顯示的是放大的熔解峰。
                       

圖2. 使用溫度內(nèi)標(biāo)能夠改善衍生的熔解曲線。熒光圖顯示了CPS1、OTC,MSH2和PAH突變94個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)。雙峰CPS1雜合子在校準(zhǔn)前很容易被區(qū)分出來(lái)（圖2a）。相反，OTC雜合子（圖2c）僅顯示了一條主要的峰，更多的峰在校準(zhǔn)前很難區(qū)分。使用溫度內(nèi)標(biāo)后的基因型數(shù)據(jù)分更加容易，重復(fù)反應(yīng)中沒有發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)不同的基因型。

表1  比較每個(gè)目的基因使用溫度內(nèi)標(biāo)前后四個(gè)重復(fù)的Tm。在所有情況下，校準(zhǔn)后差異降低。可以看出，校準(zhǔn)后標(biāo)準(zhǔn)差和非感興趣區(qū)域差異都降低。

                                                    表1.校準(zhǔn)對(duì)Tm值影響的統(tǒng)計(jì)

表1. 每個(gè)重復(fù)盤包含了相同設(shè)置的47個(gè)基因組DNA樣品（94個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)）。基于所有純合子鄰近參數(shù)預(yù)測(cè)的Tm列于表中。雜合子Tm值不包含在內(nèi)，因?yàn)樗鼈兺ǔＴ谖覀兊南到y(tǒng)中不用校準(zhǔn)就可以分型。在某種程度上，由于LCGreen染料的存在，穩(wěn)定的DNA雜交得到的實(shí)際Tm值要比理論值高5-7℃。基因分型沒有調(diào)準(zhǔn)是指未校準(zhǔn)和標(biāo)定Tm值有顯著差異。（p＜0.001）。
對(duì)于CPS1和OTC PCR產(chǎn)物，分析預(yù)測(cè)近鄰值未發(fā)現(xiàn)純合子T/T和A/ATm的不同。然而，兩個(gè)靶基因，即使沒有校準(zhǔn)， 純合子群體Tm值也是不同的。盡管，從看到的Tm值范圍上看，校準(zhǔn)前純合子T/T和A/A重疊。校準(zhǔn)后，純合子T/T和A/A沒有重疊，說(shuō)明純合子已經(jīng)區(qū)分開了（表1）。對(duì)于MSH2和PAH小片段產(chǎn)物，鄰近值分析預(yù)測(cè)純和擴(kuò)增子之間有小的Tm值差異。校準(zhǔn)前分析純合子間的變化顯示不能清楚的區(qū)分基因型。校準(zhǔn)后，純合子基因型的錯(cuò)誤估測(cè)見表2。

                                               表2.校準(zhǔn)提高純合子檢測(cè)靈敏度

表2. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了校準(zhǔn)對(duì)靈敏度的影響。可以看出校準(zhǔn)后檢測(cè)靈敏度提高10%。實(shí)驗(yàn)中，正確的估計(jì)基于近似的Tm值， 而不是Lightsanner軟件預(yù)測(cè)。每個(gè)目標(biāo)小片段的錯(cuò)估預(yù)測(cè)將顯示出來(lái)。
*OTC T/A突變的rs數(shù)未標(biāo)出。

軟件自動(dòng)校準(zhǔn)

隨后的工作是用Lightsanner 軟件自動(dòng)對(duì)相似的圖像的樣品進(jìn)行分組。這種圖形的基因分型不需要對(duì)Tm值了解。對(duì)在這種基于Tm值的基因分型已經(jīng)經(jīng)過(guò)證實(shí)，這種基于圖形的分型受益于溫度內(nèi)標(biāo)的使用。圖3可以看出通過(guò)校準(zhǔn)CPS1的小片段產(chǎn)物得到改善。

圖3. 溫度內(nèi)標(biāo)能夠改善Lightsanner軟件自動(dòng)校準(zhǔn)。下面的顯示板顯示了歸一化后的熔解曲線和不同屏幕截圖。此外，從分組情況可以看出，屏幕上左方的盒子的紅蘭灰顏色在1-6列和7-12列是重復(fù)的模式。在這個(gè)資料組校準(zhǔn)前得到的靈敏度是92%，校準(zhǔn)后得到的靈敏度是100%。

校準(zhǔn)降低Tm值對(duì)反應(yīng)量的依賴性

Tm值依靠反應(yīng)量預(yù)測(cè)，因?yàn)樵诜磻?yīng)板中更多的Mastermix或礦物油將阻礙熱量的傳遞。這將提高顯示的Tm值。我們使用OTC小片段測(cè)試Tm值對(duì)Mastermix反應(yīng)體積的依賴。從7.0 μL到12.5 μL，以0.5 μL遞增（廠家推薦為10μL）。Tm值對(duì)反應(yīng)量的依賴性在校準(zhǔn)前是很大的（slop=+0.069，R2=0.078），但在校準(zhǔn)后（slope=-0.001，R2=0.066）,見圖4。校準(zhǔn)可以有效降低量對(duì)Tm值的影響。

圖4.校準(zhǔn)前后Mastermix體積對(duì)Tm值的影響。擴(kuò)增OTC基因的47個(gè)樣品評(píng)估C.299-8T＞A突變。該反應(yīng)添加1 μL DNA模板，采用7.5 1 μL到12.5 1 μL以0.5 μL遞增的Mastermix。A板顯示的是校準(zhǔn)前重要突變的熔解圖。B板顯示的是校準(zhǔn)后減少的突變。C板顯示的是35T/T純合子樣品校準(zhǔn)前Tm值對(duì)Mastermix的量依賴性。校準(zhǔn)后可觀察到兩種情況：1）誤差線將壓縮，突變顯示減少2）斜率和R2值將大大減少，說(shuō)明Tm值和Mastermix的量關(guān)系不大。對(duì)于每個(gè)反應(yīng)在板子的不同方位分布，是為了降低Tm值對(duì)樣品位置的依賴。

結(jié)論

小片段熔解是一種簡(jiǎn)單的基因分型方法，它不需要對(duì)樣品進(jìn)行PCR后處理。盡管較小的片段能夠很好的進(jìn)行基因分型。但是，沒有溫度內(nèi)標(biāo)的純合子基因分析的成功不僅取決于高分辨率的數(shù)據(jù)采集，而且取決于樣品間buffer、體積和提取的均一性。有效的校準(zhǔn)可以消除這些混合因素的變化，以便于更好的相對(duì)穩(wěn)定的進(jìn)行純合子基因分型。

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