1 菌液的準備

1.1. 取含目的質粒的甘油菌液（-80℃或-20℃冰箱中），待菌液融化后，在超凈臺用接種環劃線于氨芐抗性的平板上，37℃倒置培養12-16h。待平板長出菌落，挑選生長狀態良好的單克隆菌落。若無目的質粒的菌液，則需取庫存質粒進行轉化，然后挑單克隆搖菌。

1.2. 將單克隆接種于5ml氨芐抗性的LB液體培養基中，37℃，220rpm/min，震蕩培養12-16h；  

1.3. 將上述的5ml LB菌液分裝到2個2ml離心管中5000g 離心8 min，棄上清（將離心管倒置于紙巾上數分鐘，除盡上清），細菌沉淀待用。

2 腺病毒質粒的抽提（參考AxyPrep™ 質粒小抽試劑盒說明書）

2.1 取250ul 已加入RNase A 的Buffer S1 對細菌沉淀進行懸浮，將細菌沉淀吹打需均勻，不應留有小的菌塊。

2.2 取250ul Buffer S2加入到上述菌懸液中，溫和并充分地上下翻轉6-8 次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；

2.3 取250ul 4℃預冷的Buffer S3加入到上述溶液中，溫和并充分地上下翻轉10 次混合均勻，直至形成緊實的凝集塊，室溫放置5 min。

2.4 將上清轉移到小抽制備管中，4℃ 5000g 離心1min，然后將小抽制備管從2 ml 離心管中取出，棄離心管中的濾液。

2.5 將制備管放置回離心管，加0.5 ml Buffer W1，5000g 離心1 min，棄濾液。

2.6 將制備管放置回離心管，加0.7ml Buffer W2，5000g 離心1 min，棄濾液；同樣的方法，再用0.7ml Buffer W2 操作一次，棄濾液。

2.7 最后將小抽制備管置回2 ml 離心管中，12,000g 離心1 min，甩干酒精。

2.8 然后將小抽制備管取出，放置于潔凈的1.5 ml 離心管中（試劑盒內提供），在小抽制備管的膜上均勻加60-80ul 的Eluent，室溫靜置1 min；然后12000g 離心1 min ，收集離心液，此為小抽質粒初液，-20℃保存。

2.9 取適量質粒初液進行質粒濃度測定，以備后續的質粒酶切線性化試驗。

3 腺病毒質粒初液的酶切線性化

小抽質粒經PacI 線性化，體系如下：

37℃培養箱中酶切過夜（17-20h左右）。

4 線性化的腺病毒質粒純化

4.1 將上述過夜酶切的產物短暫離心，轉移至已滅菌的進口EP管內；然后加入200 ul（等體積）氯仿，上下顛倒混勻， 12000 rpm離心10min。

4.2 小心吸取上層液體至新的已滅菌的進口1.5mlEP管內，加入1/10體積（上清體積）NaAc(3M pH5.2)及2.5倍體積的無水乙醇（-20℃預冷），上下顛倒混勻，此時會出現明顯的絮狀物即為DNA，-20℃中放置2-3h，13000 rpm離心15min。

4.3 棄上清，加入1ml 75%乙醇，手指輕彈EP管底部幾次，重懸沉淀， 8000 rpm離心5min，棄上清；重復此步驟。

4.4 重復步驟3.4.3，浸泡沉淀10min，離心后取出離心管，將離心管帶到細胞間生物安全柜內操作，盡可能棄上清液（最好調低壓用泵吸，這樣又快又干凈，也可用10ul槍頭吸殘液，以免沉淀被吸走），在安全柜內開蓋晾干酒精，沉淀由白色變透明即可。

4.5 加入10-20ul滅菌ddH2O溶解沉淀，4℃溶解過夜，輕彈/用槍吹打均勻后，取出0.5 ul加至含2ul ddH2O（5倍稀釋）后電泳測定DNA濃度用于濃度的測定，其余質粒-20℃保存。

4.6 計算質粒濃度，做好記錄和標記，-20℃保存。

腺病毒表達載體圖譜：

持續發布中......

參考鏈接:http://www.research-bio.com/h-col-159.html​