Cristian Cojocariu,1 Dominic Roberts,1 Michael T. Hetmanski,2 Richard J. Fussell,2 and Paul Silcock1

1Thermo Fisher Scientific, Runcorn, UK

2Food and Environment Research Agency (FERA), York, UK

 

嬰兒食品；精確質量；篩查；食品安全；GC Orbitrap；高分辨 GC-MS；農殘分析；定量分析；TraceFinder

 

農藥是廣泛用于控制蟲害的化學物質，可以用于昆蟲、植物病害和野草等對農業生產造成危害的生物。農藥使用后可能會在作物上殘留下來，因此，對這類化合物的使用都會進行嚴格的監管，以確保殘留不會超過規定允許的最大殘留水平（MRLs）1。

 

農藥分析大都使用基于液相色譜（LC）和氣相色譜（GC）方法進行的。GC與質譜（MS）聯用儀被農殘檢測實驗室廣泛使用，因為許多農藥并不適合用 LC-MS分析，或是在“軟”電離的條件下離子化效率不高。GC的分離效率比較好，并且有包括單四極桿或三重四極桿在內的多種質譜檢測器可以選擇。四極桿質量分析器是一款選擇性、靈敏度、經濟性都非常好的質量分析器，不過只能達到單位質量分辨率（nominal mass resolution）。當使用四極桿質譜儀時，通過選擇離子監測（SIM）或選擇反應監測（SRM）即可實現目標農藥與化學背景的選擇性分離。SIM 和 SRM 皆適用于定靶分析實驗，在這類分析中通常會根據一個預先確定好的農藥列表對質譜儀進行一些參數設定。這樣一來，在分析中就確定了要監測的化合物，從而限制了分析的范圍，并對未知及未定靶的化合物產出假陰性（未檢出）的結果，進而為食品安全帶來隱患。

 

這一局限性促使科學家和業界人士開始不斷努力建立新分析方法，使用能夠以全掃模式運行、質量分辨率更高、而選擇性和定量表現堪比三重四極桿的質譜分析儀。

 

到目前為止，高分辨精確質量 GC-MS 儀器尚未被廣泛接受，主要因為其全掃選擇性和定量表現尚無法與以 SRM 模式運行的三重四極桿比肩。

 

在本研究中，我們使用 GC 與 OrbitrapTM MS 聯用技術進行了嬰兒食品樣品的快速、高通量農殘分析。通過進行全掃分析，樣品中的農殘一覽無遺，為分析呈上了一個完整、不受限制的視角。此外，堪比三重四極桿且符合 SANCO 指令的定量表現在本研究中也得到了呈現。

 

首先根據已發表的方法4，使用檸檬酸緩沖液和 QuEChERS 流程對嬰兒食品樣品進行萃取。然后向終提取液（1 g/mL，乙腈為溶劑）中添加 132 種農藥的混合物，其中大部分被分析物的濃度范圍為 0.5–100 ng/g （ppb），其余為 1.0–200 ng/g。

 

全部分析均使用 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM GC 組合四極桿 –Orbitrap 質譜儀進行。進樣使用的是 Thermo ScientificTM TriPlusTM RSH 自動進樣器，色譜分離使用 Thermo ScientificTM TRACETM 1310 GC，色譜柱為 Thermo ScientificTM TraceGOLDTM TG-5SilMS 15 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 μm 薄膜毛細管柱 （P/N： 26096-1301）。更多儀器參數及細節參見下表。

 

GC 及進樣器條件
TRACE 1310 GC 參數
進樣體積（μL）：	1.0
襯管：	非對稱反折型 （P/N： 45352062）
進樣口溫度（℃）：	75
進樣模塊及模式：	PTV，低溫不分流
PTV 傳輸延遲 （min）：	1
進樣時間（min）：	0.1
傳輸速率（℃/sec）：	2.5
傳輸溫度（℃）：	300
PTV 　傳輸時間 （min）：	3
清潔速率 （℃/sec）：	330
載氣及流速（mL/min）：	氦氣，1.2
柱溫箱程序
溫度 1 （℃）：	40
保持時間 （min）：	1.5
溫度 2 （℃）：	180
升溫速率 （℃/min） ：	25
溫度 3 （℃）：	300
升溫速率 （℃/min） ：	100
保持時間 （min）：	3

 

Q Exactive GC 系統經過調諧和校準（使用校準溶液 [FC 43，CAS 311-89-7] 中質量數已知的標準品的質譜峰進行），質量精度達到 < 0.5 ppm RMS。離子化模式為電子轟擊電離（EI），掃描模式為全掃描，質量分辨率為 60,000（峰高一半處的峰寬，在 m/z 200 處測定），符合 SANCO 關于高分辨率分析儀器的推薦分辨率標準2。

色譜數據采集確保不小于每個色譜峰不少于 12 個點，以保證峰面積積分的準確性和重復性。

 

質譜儀條件
Q Exactive 質譜儀 參數
傳輸線溫度 （℃）：	280
離子化模式：	EI
離子源溫度（℃）：	230
電子能量 （eV）：	70
采集模式：	全掃
質量范圍 （m/z）：	50–500
質量分辨率（FWHM）：	60,000
鎖定質量 （m/z）：             207.03235

 

數據采集和處理使用 Thermo ScientificTM TraceFinderTM 軟件進行。 TraceFinder 軟件允許分析師為高通量篩查和定量分析建立數據采集和處理方法，還包含了譜庫檢索功能，數據審閱和報告也非常易用。

 

本研究的目的是為提高樣品通量及實驗室生產效率的同時，對基于 Orbitrap 的 GC-MS 技術在農藥快速篩查和定量方面的使用效果進行評估。我們評估了多種分析參數，實驗結果的詳細描述見下。

 

使用前述色譜條件即可實現良好的色譜分離。圖 1 給出了相同基質中標品（對應濃度為 100/200 ng/g）的色譜峰樣圖。圖示為總離子譜圖及第一個（敵敵畏，RT = 4.46 min）和最后一個（溴氰菊酯，RT = 10.33 min） 洗脫的農藥的提取離子譜圖 （XIC，±2 ppm 質量提取窗口）。如已發表文獻所述4，快速分離是高樣品通量的必要條件。

 

當 GC運行時間較短時，被分析物的色譜峰寬很窄，通常只有 2.5 秒。在峰寬如此窄的情況下，想要對每個色譜峰得到足夠多的掃描點就必須提高質譜采集速率。如果色譜峰的數據采集點不足以確定出一個高斯峰形，目標色譜峰的積分面積就很有可能出錯，從而進一步影響分析的重現性、峰形積分、以及目標化合物的定量準確性。使用 Q Exactive GC 系統在 60,000 分辨率下對嬰兒食品中的 EPTC 進行分析時的典型掃描點分布情況如圖 2 所示。 除了采集到足夠的數據點之外（每峰 17 個點），每次掃描的質量精度都非常好（0.5 ppm RMS）。

 

我們首先使用添加了農藥的嬰兒食品進行了一次簡單的定靶篩查實驗。使用 TraceFinder 軟件對一個含有 183 種農藥數據的化合物數據庫進行這次分析。數據庫里包含了化合物名稱，至少 3 個碎片離子的理論精確質量，以及樣品分析使用的色譜條件下的保留時間等信息。化合物檢測和鑒定基于保留時間（±0.1 min 窗口）、精確質量信息（±2 ppm 窗口）、同位素峰分布的相似度（理論與實際檢測），以及譜庫檢索結果（NIST 2014）進行。通過使用這些比對信息，我們成功的在嬰兒食品樣本中檢出并確認了所有 132 個 農藥化合物（10/20 ng/g）。

 

 

圖 1. 總離子譜圖 （EI 全掃描）和第一個 （敵敵畏，RT = 4.46 min） 及最后一個（溴氰菊酯，RT = 10.33 min） 洗脫的農藥的提取離子譜圖（XIC）的疊加圖。對“相對豐度”（Y 軸） 進行了調整以突出敵敵畏和溴氰菊酯的 XIC 圖。

 

 

圖 2. 狄氏劑的提取離子譜圖（XIC）（m/z 262.85642，±2 ppm 質量窗口），每峰 17 個掃描點（峰寬 2.4 秒）。數據采集在全掃描模式下進行，分辨率為 60,000 FWHM （精確分辨率見紅字注釋）。每個掃描點測得的精確質量及質量差異（ppm）已標注。

 

 

圖 3. 10 ng/g 樣本中確定鑒定出的農藥顯示在 TraceFinder 軟件篩查結果瀏覽器中。化合物識別和確認（以艾氏劑為例）的依據是準確質量（±2 ppm 質量窗口）、 保留時間（RT）、同位素峰分布（IP） 和碎片離子（FI）。圖中可見測定的與理論的同位素峰。

 

圖 3 以艾氏劑為例展示了化合物檢測和鑒定工作流程。先將全掃模式下采集的數據解卷積，再使用保留時間和準確質量信息進行化合物鑒定。艾氏劑的鑒定是基于 RT、定量離子和特征碎片離子的精確質量（<0.5 ppm 質量誤差）進行的。此外，定量離子的元素組成（C7Cl5H2）也被用于比對理論和實際測得的同位素峰分布的吻合程度。如圖 3 所示，艾氏劑的同位素分布達到了 100% 吻合，進一步提高了化合物鑒定結果的可靠性。

 

我們還就 Q Exactive GC 系統對化合物定量的分析表現針對所有 132 種農藥進行了評估。為此目的，我們在 0.5–100 ng/g （或 1.0–200 ng/g）濃度區間內配制了基質工作曲線標樣，并針對系統的靈敏度、線性區間、和峰面積重現性進行了評估。此外，我們還在整個濃度區間內評估了目標農藥的質量精確度。

 

幾乎對所有農藥（95%）都在最低濃度的基質匹配標樣（0.5 或 1.0 ng/g）中實現了成功檢測。此濃度下的色譜圖實例參見圖 4。在 5 ng/g 濃度水平，所有化合物的離子比率值與整個工作曲線濃度范圍內的離子比率均值的差異不超過15%。

 

為評估系統靈敏度，我們計算了每種農藥的 IDL。目標農藥的 IDL 指的是在背景噪音之上、系統能夠實現穩定、可靠檢測的最小信號。這個信號強度的確定是通過使用 5 ng/g （或 10 ng/g）基質匹配樣品進行反復（n=10）進樣檢測，并計入相應自由度下 Student’s-t 檢驗的關鍵值（99% 置信區間）確定的。本實驗測得的峰面積重現性的 % RSD 為 6% （圖 5）。

 

 

圖 4. 0.5 pg 特丁津（柱上濃度）的定量離子與三個確證碎片離子（左）的 XIC 疊加圖。每個離子的實測質量及質量誤差（ppm）已標注。質譜圖 （右）突出了定量和確證使用的離子，放大的區域顯示了強度最低的碎片離子（m/z 138.07737），檢測的質量精度為 0.3 ppm。

 

 

圖 5. 所有 132 種測定的農藥在柱上5 或10 pg 濃度水平下的絕對峰面積可重現性 （% RSD，n=10）。圖示為平均 %RSD 值（實線）。

 

Q Exactive GC 系統農殘檢測的所有 IDL 均低于歐盟針對嬰兒食品規定的典型 MRL。目前絕大部分農藥的 MRL 都定為<0.01 mg/kg（10 ng/g）3 。我們還與 Thermo ScientificTM TSQTM 8000 Evo 三重四極桿 GC-MS/MS 系統檢測相同農藥的IDL 進行了比較。本次實驗的結果表明 Q Exactive GC 系統與 TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 系統的靈敏度相當，91% 的被測農藥 IDL < 2 ng/g （圖 6）。

 

 

圖 6. Q Exactive GC 系統 （左）與 TSQ 8000 Evo GC-MS/MS 系統 （右）分析 5 ng/g 基質匹配標樣中 132 種農藥的計算 IDL99（ng/g）值比較。圖中標出了相對于目標化合物總數（132）的農藥百分比以及相應的 IDL 區間。

 

能夠持續穩定測定準確質量的能力對于農殘鑒定和利用儀器的分辨能力保持高度準確將被分析物與基質干擾的區分至關重要5。通過進行一系列重復進樣分析（n = 10）我們對所有 132 種農藥檢測的質量準確度在 5 ng/g（或 10 ng/g，具體根據化合物確定）濃度水平進行了評估。沒有任何被分析物的質量偏差值超過 1 ppm，整體質量準確度的平均值為 0.4 ppm, 為檢測的準確度和選擇性提供最大信心保障（圖 7）。

 

 

圖 7. 嬰兒食品樣品中鑒定出的農藥在 5（或 10） ng/g 濃度水平的準確質量測定結果（n = 10 的平均值）。

 

我們還在 0.5–100 ng/g （有些被分析物為 1–200 ng/g）濃度范圍內評估了定量響應的線性程度，樣品為進行過基質匹配的校準標樣，每個濃度水平進行 3 次平行進樣。在所有情況下，決定系數（R2） 均 > 0.99，平均值為 R2 = 0.997， 漸近線的回歸殘差 < 25%。化合物線性擬合的樣例參見圖 8。

 

* 即便是在進行快速 GC 分離的情況下，Q Exactive GC 系統能夠為大規模農殘分析在全掃模式下提供高定量分析表現。

* 本系統的高速掃描、高分辨能力、出眾的質量精度、以及全掃描模式下的靈敏度幫助分析人員在極低水平下實現準確、可重復農藥定量分析。

* 以 60,000 FWHM（m/z 200）的常規質量分辨率進行數據采集能夠消除同質量化合物的干擾，提高在復雜基質中篩查農藥的結果可信度。對所有化合物都持續保證亞 ppm 水平的質量精度，確保化合物鑒定結果可信。

* Q Exactive GC 系統的定量表現足以匹敵 GC 三重四極桿質譜系統。

* Thermo Scientific TraceFinder 軟件使得分析人員能夠快速、準確地進行高通量篩查和定量分析。

 

 

圖 8. 普硫松和苯霜靈在 0.5–100 ng/g 濃度區間內的決定系數（左）和回歸殘差（%RSD）。

 

1. Commission Regulation (EU) No 396/2005 on maximum residue levels of pesticides in or on food and feed of plant and animal origin and amending Council Directive 91/414/EC, 16.3.2005, p. 1–16.

2. SANCO/12571/2013 (2014), Guidance document on analytical quality control and validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed, 19.11.2013 rev.0.

3. Commission Directive (EU) No 2003/13/EC amending Council Directive 96/EC on processed cereal-based and baby foods for infants and young children, 14.2.2003, p.33-36.

4. Thermo Scientific Application Note 10432: Three-Fold Increase in Productivity for Pesticide Residue Analysis in Baby Food Using Fast Triple Quadrupole GC-MS/MS.

Runcorn, U.K. [Online] http://www.thermoscientific.com/ content/dam/tfs/ATG/CMD/cmd-documents/sci-res/app/ms/GC-MS/AN-10432-GC-MS-Pesticides-Baby-Food-AN10432-EN.pdf (accessed Apr. 3, 2015).

5. Thermo Scientific Technical Note 10455: High Mass Resolution is Essential for Confident Compound Detection.

Runcorn, U.K. [Online].

 

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