藥物雜質因其可能對藥品質量、安全性和有效性產生影響，目前成為國內外藥品監管機構的重點關注內容之一。隨著我國醫藥產品出口規模的擴大，了解國外法規市場的藥物雜質控制要求、加強對藥物雜質的分析與控制已成為國內藥品生產企業共同關注的話題。

 

任何影響藥物純度的物質統稱為雜質，人用藥物注冊技術要求國際協調會（簡稱ICH）對雜質的定義為藥物中存在的，化學結構與該藥物不一致的任何成分。藥物中含有雜質會降低療效，影響藥物的穩定性，有的甚至對人體健康有害或產生其他毒副作用。因此，檢測有關物質，控制純度對確保用藥安全有效，對保證藥物質量非常重要。

 

雜質譜分析是指研究藥物中存在的已知和未知的雜質的分布情況，分析藥物中雜質的來源和去向，通過雜質譜的研究，可以全面的評估藥物的安全性。對于藥物生產階段，雜質譜研究可以在工藝過程中建立完整可靠的雜質分析方法，對工藝的關鍵步驟監控雜質的變化情況，驗證雜質分析方法并轉移到QA/QC，對于藥物研發階段，需要對藝研發過程中的雜質進行鑒定和表征并進一步確認雜質的來源，研發人員根據分析結果可以評價藥物的安全性和與原研藥的一致性，并根據雜質來源進一步優化工藝，降低或消除雜質的產生。

 

有機雜質主要起源于起始原料及其本身所含雜質、生產過程中帶入的合成中間體與副反應產物、成品在儲存過程中產生的降解產物，輔料帶入的雜質或輔料相互作用降解產生的雜質，及藥物與包材相互作用產生的雜質。有機雜質在成品藥物中含量通常很低，制備純化需要消耗大量人力物力，常規分析方法難以應對多組分、低含量的雜質結構解析工作。離子阱質譜儀，因其靈敏的MSn 能力，復雜樣品的高通量常規分析，高質量的結構信息，快速正負離子切換技術，快速正負離子切換技術，穩定、可靠、便于操作，被廣泛的應用于藥物雜質研究，臨床和法醫鑒定，天然化合物鑒定，代謝物鑒定等領域。

 

 

藥物中的雜質往往含量很小，在大量的母藥存在下，檢測到微量的雜質是對質譜技術的一大挑戰，采集到雜質的質譜信息后，對這些工藝雜質或降解產物的結構進行有效的解析是另一大挑戰。Thermo 的離子阱技術有效地解決了以上雜質研究難題，其高靈敏度和寬廣的動態范圍能夠采集到微量雜質的有效質譜信息，離子阱的多級質譜能力和強大的解析軟件可以對雜質結構進行深入的剖析，同時結合色譜高效的分離能力和專業的結構解析軟件，Thermo 建立了專門針對雜質分析的解決方案。

 

 

圖1. 基于離子阱的雜質解析流程

 

 

離子阱是時間串聯的質譜技術，化合物離子的捕獲，隔離，激發和拋射都在阱中完成，正因如此，離子阱重復此掃描過程即可完成多級碎裂（MSⁿ）。

 

 

圖2. 離子阱時間串聯掃描

 

離子阱中的穩定區域可以通過馬紹方程計算出來，化合物離子在特定的射頻電壓下按照特定頻率移動，增加RF 電壓， 離子的頻率（q 值）將會增加，逐漸提高射頻, 使離子從低m/z 到高m/z 逐漸依次離開，完成掃描。

 

 

圖3. 離子阱掃描原理

 

作為離子阱質譜的領導者，Thermo 專利的線性離子阱提供最快的速度同時保證優異的靈敏度

● 離子沿著中心線方向聚集，同時也減少了空間電荷效應，極大提高離子容量；

● 雙徑向檢測器設計同時檢測離子，離子檢測速度更快，響應強度更高，信號更加穩定；

● 離子捕獲效率更高，獲得更高的靈敏度，進行更多級數的碎裂；

 

● 最大序列覆蓋率，源自卓越的循環時間和靈敏度

● 自動MSn 觸發數據依賴中性丟失掃描

● 靈活的離子化模式、進樣口和色譜解決方案

 

● 優異的離子統計學使定量穩定可靠

● 碰撞能量歸一化獲得最高工作效率

● 為規范實驗室提供同時定性和定量數據

 

● 持久穩定性適應復雜基質樣品可靠定量

● 正、負離子模式下同時定量和定性

● 簡便地操作提高實驗室效率

 

● 出色的MSn 譜圖質量和全掃描采集技術

● 低濃度代謝物結構確認，無需了解MRM 信息

● 數據依賴和動態排除技術可以從復雜樣品中獲得最多信息

 

 

Thermo 離子阱提供豐富的采樣模式，既有通用模板幫助快速建立分析方法，又有拓展功能滿足深入分析的需要。

 

 

注：Zoom 掃描是通過降低掃描速度增加分辨率的一種離子阱掃描方式

 

雜質研究過程中通常需要對藥物中的已知或目標雜質進行分析，離子阱的選擇反應監測（SRM）可對雜質特定的母離子和子離子進行掃描，保證結果的特異性和準確性，連續反應監測（CRM）更可對雜質特定的母離子，子離子和多級離子進行掃描，獲得更高的靈敏度和抗干擾能力。下圖中采用SRM 對目標化合物的母離子m/z 258 和子離子進行掃描，可看到在2.65min 有一明顯色譜峰，在采用CRM 進一步對目標化合物的三級離子m/z 133 進行掃描后，2.65min 的化合物背景干擾明顯降低，信噪比有了大幅提升。

 

 

圖4. 多級質譜提供更高的特異性與靈敏度

 

未知雜質的鑒定是雜質研究工作中非常重要的一部分內容，因為結構未知，如何采集到準確的雜質母離子和多級質譜信息成為結構解析的前提和關鍵。數據關聯多級質譜及動態掃描功能可以實現對未知雜質信號的采集。

 

如下圖所示，離子阱通過一級掃描，獲得化合物質譜信息，根據質譜響應強弱自動選擇母離子進行多級質譜掃描，一次進樣即可獲得雜質多級質譜信息。

 

 

圖5. 數據關聯掃描同時采集已知與未知雜質

 

在采用數據關聯掃描對洛哌丁胺藥物的分析中，離子阱通過全掃獲得一級質譜信號，然后對響應最強的洛哌丁胺母離子進行二級碎裂，然后自動選則m/z 266 和m/z 210 兩個主要二級離子進行三級碎裂，緊接著對由二級離子m/z 266 產生的三級離子m/z 210 和m/z 238 進行四級碎裂。數據關聯掃描可以在一次進樣內，即自動完成多級質譜過程，無需預先知道樣品中的化合物信息，提高了分析通量和數據信息量。

 

 

圖6. 數據關聯掃描采集洛哌丁胺多級質譜數據

 

動態排除功能：在藥物雜質研究中，常涉及到從液相方法到液質方法的轉移過程，而液質方法因為流動相與液相不同，往往無法在短時間內將所有雜質分離，離子阱具有動態排除功能，開啟后可以對所有共流出雜質進行多級碎裂，以應對色譜未完全將雜質分離的情況。

 

在下圖中，化合物m/z 452和m/z 407發生了共流出，開啟動態排除后，儀器首先對響應較高的m/z 407進行二級碎裂，然后將m/z 407 放入排除列表，在下一次全掃中，響應較高的m/z 407 即作為排除項，轉而選擇響應較弱的m/z 452 進行二級碎裂。所以在一個色譜峰內，即使有多個化合物存在，動態排除都能保證采集到每個化合物的多級質譜信號。

 

 

圖7. 動態排除采集共流出雜質組分

 

 

雜質的種類繁多，即使是相同元素組成的化合物，結構也可能完全不同，所以需要對采集到的數據進行有效的解析，對推測的結構式進行判斷，Mass FrontierTM為質譜譜圖的管理、評估和解析提供精密的特性。它可廣泛應用于小分子結構鑒定，應用范圍涉及包括藥物開發、雜質的分析和毒理研究過程中代謝產物的識別等廣闊領域。

 

 

圖8. Mass Frontier結構解析軟件

 

使用Massfrontier，研究人員可以方便的從已采集的數據中獲取以下信息：

 

● 化合物的裂解機理

因為雜質的結構和母藥的結構往往類似或者具有淵源，所以了解母藥的裂解規律可以幫助判斷雜質的碎片結構，進一步推測出雜質的結構。

 

以前的方法僅僅依靠研究者的個人經驗，或者純理論的計算，使得數據分析的重現性和準確性受到了限制。

 

 

圖9. 傳統結構解析方法

 

Mass Frontier 所含有的Fragmentation LibraryTM 碎裂機理譜圖庫是從現存的所有關于質譜的出版物中收集而來，幾乎涵蓋了所有已發表的文獻。每一種機理，連同其化學結構，都經過人工和自動核對，然后連同標題、作者及信息來源等附帶信息一塊儲存于譜圖庫中。譜圖庫所收集的信息，加上通用的電離、碎裂和重組規則，為碎裂機理的預測提供了有力的保障。Mass Frontier 還可以允許用戶創建基于客戶自定義碎裂機理上的譜圖庫，并能學會并運用這些機理來智能預測碎片分子。

 

 

圖10. Fragmentation Library根據已發表文獻提供霉酚酸酯雜質裂解機理

 

● 有關物質的檢獲

一些雜質組分會因為信號響應太低，或者形成的色譜峰不夠尖銳，而被研究人員忽略，但是含量很低的毒性雜質嚴重的影響藥物安全性，漏檢不僅會極大的影響用藥的安全性，也會間接影響到新藥申報。

 

MassFrontier 的Fragment Ion Search (FISh) 可通過過濾無論是由理論裂解預測還是由實驗MSn 質譜譜樹獲得的一組裂解碎片可對結構相似化合物進行快速篩選，通過雜質與母藥的碎片比對查找，精確的找出所有有關雜質。

 

 

圖11. Fragment Ion Search (FISh)檢索霉酚酸酯痕量雜質

 

線性離子阱多種解離技術對阿德福韋酯雜質譜的全面鑒定