蛋白提取的常見問題分析
Q：如何進(jìn)行組織液氮研磨？
A：將組織塊在液氮里凍實，敲成大小合適的小塊后放在研缽里，倒液氮，邊研邊加，保持研缽里有液氮，或是保持組織塊不融。研碎了就行了。注意做前研缽等器具要預(yù)冷，用液氮或是先放負(fù)二十冰箱一段時間。
注意事項：1.液氮研磨的研缽，藥勺必須預(yù)冷。2.開始研磨前，將研缽置于冰袋上，并加入少量的液氮，快速將樣品轉(zhuǎn)入其中。3.繼續(xù)加入液氮，快速搗碎樣品，然后快速研磨。4.待液氮揮發(fā)完前，繼續(xù)加入液氮，快速淹沒，重復(fù)操作，待樣品變成非常細(xì)小的白色干粉時即可。5.將干粉刮下轉(zhuǎn)入裂解液中，再加裂解液于研缽中，將其中的黏附的樣品洗下。整個過程保持樣品處于溫度低的環(huán)境，研磨的速度要快而有力度。這樣才能破碎細(xì)胞，同時不降解蛋白。
Q：膜蛋白不溶于loading buffer，或者煮沸后形成沉淀怎么辦？
A：用60度變性1h；如果還是不行，把loading buffer的SDS換成LDS。
Q：多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot？
A：一般5×106足夠。但要看是哪種細(xì)胞，有的細(xì)胞的體積就很小，而有的細(xì)胞則鋪得很開。常規(guī)做WB一個孔道上樣要105個細(xì)胞。但也和目的蛋白及提取的方式有關(guān)。如果是膜蛋白或是某細(xì)胞器內(nèi)分布的蛋白細(xì)胞數(shù)得增多。
Q：同一蛋白樣品能同時進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
A：可以，甚至可以同時測十幾種樣品。
Q：蛋白提取后可以存放多久？
A：－80℃，一年沒有問題。關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌污染
Q：提取蛋白后做WB一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？
A：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關(guān)系，也與顯色時間長短有關(guān)。開始摸條件時，為了拿到陽性結(jié)果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。
Q：做組織樣品蛋白的western的時候，提取蛋白有什么特別注意的嗎？
A：必須進(jìn)行研磨、勻漿處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制劑cocktail）。
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蛋白提取
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