細胞培養生化分析儀選購指南

單抗類藥物的出現為人類一些自身免疫病、癌癥等疑難病的診斷與治療開辟了廣闊前景，在為人類健康作出突出貢獻的同時也為企業帶來非常可觀的收入，已成為近年來銷售額最高的一類生物技術藥物。雖然哺乳動物細胞培養技術要求高、抗體表達能力低、生產成本高，但具有其它表達系統無法取代的優勢 ：能夠準確的完成糖基化、折疊、鏈內及鏈間二硫鍵的形成等一系列翻譯后修飾，因此其表達的抗體在分子結構、理化特性和生物學功能方面更接近天然產物。自 1996 年以來，FDA批準的生物技術產品中，有 2/3 以上是通過哺乳動

物細胞系統生產的。而中國倉鼠卵巢細胞（CHO）約占哺乳動物細胞表達的90%以上，中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO）由于具有抗剪切力，易于放大培養的優勢，是目前使用最廣泛的哺乳動物細胞表達系統。目前使用最廣泛的 CHO 表達系統是二氫葉酸還原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（Glutamineynthetase，GS）表達系統。

近年來關于CHO細胞大規模培養的研究越來越多，在很多情況下生物反應器中哺乳動物細胞生產的蛋白質類產品的產量都已達克級有的甚至可達10克級，比80年代中期提高了100多倍，用于治療各種疾病的生物產品的種類也越來越多，這些成果的取得大都依賴于工程宿主細胞的改良，培養基的優化以及許多其他工藝流程的創新。基因組的勘探和細胞工程技術的普遍應用大大方便了科學家對宿主細胞的改造，賦予細胞生長和蛋白產品所期望的特點。

一、生化分析儀在細胞培養中的應用

1. 監測代謝廢物的積累
       目前公認，在分批培養和大多數流加培養中，乳酸、氨以及其它代謝產物隨著時間的延長在培養基中積累，這些產物抑制了細胞的生長。乳酸一直被認為是在生物反應器中實現高密度細胞濃度的一個障礙，人們一直在為減少乳酸的產生做了各種不懈的努力。科學家推測乳酸的積累（即葡萄糖通過糖酵解生成乳酸，而不是進入線粒體完全氧化）一個原因可能是丙酮酸進入線粒體受到了限制，或者TCA循環和氧化磷酸化發生了障礙。這一猜測意味著，如果有足夠的碳流量（主要是丙酮酸）進入線粒體產能以及足夠的化學能流出（ATP）到細胞質中，然后以某種方式通過負反饋調節機制，葡萄糖的過度消耗就會減少，乳酸的產生也隨之降低。一些其他的因素比如高滲透壓以及活性氧的積累都有可能對細胞生長帶來損傷，最終導致細胞活率以及蛋白產量的降低。乳酸和氨的積累對細胞培養的影響比較復雜，對細胞的生長、蛋白產量以及細胞代謝的帶來的變化都有報道。盡管乳酸和氨可能不是培養基中產生的唯一的抑制物，但是它們的積累確實影響了細胞的生長速度，同時乳酸和氨也是灌流培養反應器中需要去除的主要代謝產物。

    CHO轉化細胞無論是在氧氣充足還是氧氣缺乏的時候都傾向通過糖酵解代謝大量的葡萄糖， 這將導致大量的乳酸的產生，這種現象被稱為Warburg 反應。

最近有研究報道對細胞的這種現象做出了解釋，他們認為這是細胞快速的將環境

中的營養物質轉化為細胞生物量的一個適應過程。然而不同的細胞所耐受的乳

酸濃度也不一樣， 例如當培養基中乳酸濃度高于55mM時，雜交瘤細胞的生長速率降低50%,當乳酸濃度高于60mM時，CHO細胞的生長速率降低25%。

1. 確定流加工藝關鍵控制點

目前上市的重組抗體中絕大多數是采用流加（Fed batch）培養工藝生產，這主要由于與之配套的生物反應器（攪拌罐、氣升罐等）制造成熟，可線形放大（最大至20,000L），操作簡單等原因。但是，流加培養過程中會出現營養物質消耗、代謝廢物積累，以及產品質量不穩定等問題。因此需要對流加過程進行監控以減少代謝副產物的積累， 使細胞培養時間得以延長，細胞密度以及蛋白類藥物的產量也都能得到增加。

而流加培養中減少代謝物的主要途徑就是通過控制補料方式減少可利用的葡萄糖以及谷氨酰胺使葡萄糖的濃度維持在較低的水平。實驗結果表明，當外部的葡萄糖和氨基酸濃度控制在較低水平時，細胞代謝傾向于向更有效的途徑轉變，過度代謝的流量和代謝物的排泄將大大減弱， 表現為培養基中乳酸的生成大大減少， 細胞代謝從一個高產乳酸的狀態轉變為低產乳酸的狀態。

1. 優化培養基配方

動物細胞的體外培養，涉及生物反應器的物理參數（溫度、pH、DO、DCO2等）、培養基的營養成分（葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、維生素等）的消耗，以及自身代謝產物（乳酸、氨、重組蛋白等）的積累與生理生化參數（細胞密度、活性，能荷等）的變化。作為重組抗體生產的“細胞工廠”，上述過程參數的改變會直接影響生產細胞系的活性與重組抗體的收率。比如：當乳酸（58 mM）、滲透壓（382 mOsm/kg）、氨（5.1 mM）參數超過其相應的閾值，細胞活性和抗體產量均會明顯下降[6]。目前，業內已經對于細胞培養過程參數進行了深入的研究，在動物細胞大規模培養中下述參數的控制也已成定式（見下表）。

流加培養工藝的優化主要集中在基礎培養基、流加培養基以及流加策略上，其優化的原則是根據細胞的代謝特點設計補料培養基，用于補充易耗成分，降低副產物積累。

• 生化分析儀選購原則

1.生化分析儀的分類

生化分析儀又常被稱為生化儀，是采用光電比色原理來測量體液中某種特定化學成分的儀器。由于其測量速度快、準確性高、消耗試劑量小，現已在各級醫院、防疫站、計劃生育服務站得到廣泛使用。配合使用可大大提高常規生化檢驗的效率及收益。

  常見的生化分析儀基于兩種基本原理：第一是酶比色法也就是傳統意義上的生化分析儀，第二是類是隨著生物科技的發展酶分子改造技術、酶的固定化技術的發展酶電極法生化分析儀應用而生，主要應用于戰地醫療、ICU等對檢測速度、檢測環境又特殊要求的場合。

1.1光學比色生化分析儀發展歷程

第一代：分光光度計

第二代：半自動生化分析儀：半自動生化分析儀指在分析過程中的部分操作（如加樣、保溫、吸入比色、結果記錄等某一步驟）需手工完成，而另一部分操作則可由儀器自動完成。

第三代：全自動生化分析儀：1957年誕生于美國，全自動生化分析儀，從加樣至出結果的全過程完全由儀器自動完成。操作者只需把樣品放在分析儀的特定位置上，選用程序開動儀器即可等取檢驗報告。按照儀器結構原理可分為 ：連續流動式（管道式）、分立式、離心式和干片式四類。

1.1.2光學比色生化分析儀檢測過程

（1）檢測原理（針對細胞培養項目）：底物經過一系類的酶的作用生成過氧化氫，過氧化氫與4-氨基安替比林反應生成紅色醌類物質在540nm處有吸收峰。

（2）檢測過程：加樣——加試劑——混合——保溫反應——檢測——輸出結果。

1. 酶電極法生化分析儀

2.1 檢測原理：底物經過一系類的酶的作用生成過氧化氫，過氧化氫在電極表面形成電勢差，電勢差的大小與過氧化氫的濃度成正比。

2.1 檢測過程：定標——進樣——酶膜表面反應——檢測——輸出結果

3.生化分析儀檢測速度

由生化分析儀的誕生背景、檢測原理、檢測過程可知，兩種方法的生化分析儀在檢測同一個樣本，同一個項目時間上有很大差異。

1. 單個樣本檢測成本

生化分析儀目前的主流應用在醫療領域，大型醫療機構每天有上千個樣本進行檢測，因此生化分析儀的試劑包正常情況下也是500T起，并且每個公司的生化分析儀都會有自己特殊條碼系統，耗材之間不能通用，由于條碼系統的存在，耗材很容易實現壽命控制（試劑包從掃碼之日開始計時，一定時間之后試劑包自動失效，要求客戶重新更換試劑包，否則儀器無法檢測），臨床生化分析儀的盈利模式主要依靠耗材，所以常規醫療用生化分析儀不適合細胞培養行業。

1. 日常維護成本

目前無論是細胞行業還是臨床，生化分析儀即使不用也要進行日常維護，所以作為工業客戶，本著為公司經濟效益著想，首先要考慮的就是儀器的日常維護的耗材成本、人力資源成本和時間成本。

三、總結

生物類似藥因結構極為復雜，研發壁壘大大高于化學仿制藥，存在研發周期長、資金投入大、技術要求高的特點。從行業普遍規律來看，單抗生物類似藥的研發大約需要約 5-10 年的時間，研發費用約 2-3 億美元。但對比生物創新藥，不僅研發和審批難度大大降低，還可以享受創新藥培育好的市場，對于制藥企業來說，特別是資金和原創能力不足的企業，研發生物類似藥可保證以相對較低的投入獲取相對高的收益。隨著布局生物類似物研發的企業逐步增多、融資渠道日益多元，必將會有越來越多的制藥企業押寶生物類似、蛋白類藥物。

3月20日，在十三屆全國人大一次會議閉幕后，國務院總理李克強在答記者問時表示，我們要較大幅度地降低進口稅率，對抗癌藥品力爭降到零稅率。這對長期依附于進口的蛋白類制藥企業是個巨大的挑戰，進口藥品勢必大幅降價。因此降低企業日常運營成本、掌握細胞培養核心技術、提高細胞表達水平是取得最終成功的必由之路！西爾曼科技愿為您的細胞培養優化過程提供專業、可靠的解決方案。