選擇合適的色譜柱
 
微粒。通過與柱內填充微粒疏水表面的相互作用實現蛋白質與多肽的分離。
柱內填充粒通常以硅膠為基礎，這是因為硅膠的穩定性高，能夠在大多數溶劑條件下（除了pH大于6.5的情況）保持穩定，此外，硅膠可以形成各種大小的具有不同直徑的多孔球形顆粒。

硅膠純度。高效液相色譜柱所用硅膠填料的純度對分離性能至關重要。金屬離子雜質會導致峰拖尾和分辨率下降，如圖7A所示（0.01%和0.005%的TFA）。
含金屬離子雜質（圖7A）的硅膠需要采用高濃度離子對試劑（如三氟乙酸（TFA））維持良好的峰形。

 

 

圖7. 硅膠純度會影響多肽的峰形，尤其是加入的離子對試劑濃度較低時。高純度硅膠所需離子對試劑的濃度遠比低純度硅膠低。

 

洗脫液：加入如圖所示的TFA，以10%-55%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時間為37.5分鐘。

低濃度TFA會導致峰形較差且分辨率下降。硅膠純度較高時（圖7B），0.005%的低濃度TFA會產生良好的峰形。這在液相色譜-質譜聯用法中尤其重要，因為在使用電噴霧接口時TFA會導致信號減弱。液相色譜-質譜聯用法中低濃度的TFA會獲得更好的檢測信號。

 

孔徑。通常，反相高效液相色譜法中小孔（~100埃）硅膠分離蛋白質的效果較差。大孔硅膠（~300埃直徑）可以更好地分離蛋白質（參考文獻4）。
如圖8所示，蛋白質無法進入小孔，只與極小的外表面相互作用實現分離。
大孔硅膠允許蛋白質，甚至更大的多肽進入小孔，從而與疏水界面充分作用，因此最終的峰形更好，分辨率更高。如今，大孔硅膠已普遍應用于蛋白質的分離中。
由蛋白酶水解等產生的小分子肽能夠進入小孔硅膠的孔隙內，從而與疏水界面相互作用，因此小孔硅膠也可用于蛋白質水解物的分離。
但是大孔硅膠也能較好地分離多肽，且具有不同的選擇性和分辨率。

 

 

圖8. 反相高效液相色譜（左側）常用的小孔（~100埃）粒子只允許少量蛋白質進入孔內，因此限制了表面相互作用。大孔粒子（~300埃，右側）允許蛋白質進入孔內與疏水界面相互作用。

疏水界面。用碳氫化合物分子對硅膠進行改性，從而形成疏水界面。
含烴鏈的氯硅烷，如十八烷基氯硅烷，與硅膠（表面有極性硅烷醇基）反應使碳氫化合物附著在硅膠表面（圖9）。
由于位阻效應，有機硅烷分子僅與硅膠表面部分硅烷醇基反應，因此大量的極性硅烷醇基仍然會留在硅膠表面。
在“封端”過程中，較小的有機硅烷依次與極性硅烷醇基反應，從而減少硅膠表面極性硅烷醇基的數量。
 

選擇分離表面。硅膠表面改性所用的化學過程允許多種有機基團附著在硅膠表面。
最常見的改性是鍵合一條十八碳線性脂肪鏈，形成“C18”柱或ODS柱（圖10A）。
如圖所示，有機氯硅烷與大多數硅烷醇基反應，但仍有部分不反應，這會在硅膠表面形成一層較厚的碳氫化合物層。
蛋白質和多肽可以吸附到該碳氫化合物層。
C18柱尤用于分子量小于2~3000道爾頓多肽的分離，并且通常是分離由蛋白酶水解蛋白（見26~31頁）產生的多肽以及分離天然和合成肽的選擇柱。
由丁基鍵合至硅膠表面形成的疏水相較少（圖10B）。
丁基相最適合蛋白質分離，但也可用于分離大分子肽或疏水性肽。
 

圖9. 通過利用有機氯硅烷將疏水性配體化學鍵合到硅膠表面形成了疏水界面。

蛋白質可用C18柱分離，但一些蛋白質利用C18柱分離峰形較差或出現拖尾峰，因此蛋白質分離推薦用C4柱。
其它用于多肽分離的柱包括苯基柱（參考文獻6），其在疏水性方面與C4柱類似，是一種極性嵌入或極性封端柱，能夠增強多肽與硅膠粒子表面的相互作用。
因此，對多肽具有不同的選擇性。

多肽選擇性。柱對多肽的選擇性受鍵合相性質和特征以及底層硅膠表面的影響。不同的反相柱具有不同的多肽選擇性。尤其是：

• 硅膠表面的相數（碳負載）影響選擇性。當鍵合到硅膠表面的碳氫化合物較少時（較低的碳負載），相比于碳負載更高的柱，極性硅烷醇基對分離的影響更大，因此會導致選擇性不同。

• 不同的制造工藝會產生性質不同的硅膠，從而影響多肽的選擇性。

圖10.

 

A    C18疏水柱用于分子量小于2000-3000道爾頓多肽的分離效果極佳
B      C4疏水柱用于分子量大于3000道爾頓的多肽以及蛋白質的分離效果極佳。

 

 

柱長度。小分子與硅膠粒子表面相互作用越多,分辨率就越高；采用長柱比短柱的分辨率高。

但吸附在柱頂附近的蛋白質隨后會被洗脫下來,被洗脫后與硅膠粒子表面的相互作用就不再明顯（圖11）。

 

盡管數據顯示蛋白質與硅膠粒子表面仍存在部分相互作用，但這種相互作用不具選擇性，不能提高蛋白質間的分辨率。

 

 

柱的長度對蛋白質的分離沒有影響，短柱和長柱的分離效果相同。

 

由于與蛋白質相比，多肽與疏水性反相粒子表面的相互作用較弱，因此柱的長度在多肽和蛋白質水解物的分離中的影響更大。

如圖12所示，采用長柱分離多肽的分辨率通常比短柱要高。

多肽分離建議采用長度為15或25厘米的色譜柱。

 

圖11. 蛋白質在柱頂附近吸附和解吸。解吸后，蛋白質幾乎不與疏水相發生相互作用，因此增加柱的長度不會提高與蛋白質的分辨率，而會提高與小分子的分辨率。

 

圖12. 與蛋白質相反，多肽通常在長柱上分辨率更高。

色譜柱：C18小孔，4.6 x 150或250 mm
洗脫液：梯度：0 - 70% 乙腈，60分鐘洗脫

 

 

柱內徑。分析型HPLC柱的標準內徑為4.6 mm。此類柱的最佳流速為~1 ml/min。

市場上可買到孔徑更小的柱，多用于滿足特定要求和目的。

細孔柱（~2 mm內徑）的流速為~ 200微升/分鐘，因此與4.6mm內徑的分析柱相比，所用溶劑更少。

同時，細孔柱的靈敏度約為標準分析柱的五倍。

這是因為每分鐘流過檢測器的溶劑量更少，導致蛋白質或多肽的峰值濃度更高。

紫外檢測器和電噴射質譜儀等濃度型檢測器對小孔柱的靈敏度更高。

 

微徑柱的流速為~50微升/分鐘，因此采用微徑柱的靈敏度更高，約為分析柱的50倍。

毛細管柱的流速為1~50微升/分鐘，具有更高的相對靈敏度，約為分析柱靈敏度的200倍。

但由于所采用的流速和更大的死體積，微徑柱和毛細管柱需要特殊儀器。

在使用微徑柱的過程中必須格外小心。

圖13和附錄中總結了柱的特性。

 

圖13. 不同內徑色譜柱的特性