Ca2+作為普遍的第二信使在細胞信號轉導過程中起著非常重要的作用，是單個細胞生存和死亡的信號。它參與了神經傳導、血液凝固、肌肉收縮、心臟收縮、大腦功能、酶功能以及內分泌腺的激素分泌等各種生理機能。而人們對Ca2+在信號轉導中作用的認識，則很大程度上取決于Ca2+測定技術。

目前常用的Ca2+檢測方法主要有：Ca2+選擇性微電極測定法、同位素示蹤法、核磁共振法和水母發光蛋白檢測法等。
 

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Ca2+選擇性微電極測定法:Ca2+選擇性微電極一種電化學敏感器。利用內充液和組織或細胞之間產生電位差，理想情況下，該電位差是Ca2+對數的線性函數，遵循Nernst方程。

優點：直接、敏感地測定組織或細胞內的Ca2+，不需使用指示劑，不影響結合鈣和游離鈣的平衡。

缺點：反應速度慢而無法測定Ca2+的快速變化，而且穿刺損傷細胞可引起滲漏，且不適用于太小的細胞。

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同位素示蹤法：用放射性核素45Ca2+對Ca2+進行示蹤，可測量出通過細胞膜轉運到細胞內Ca2+增加的速度及濃度的大小，揭示Ca2+泵的作用，目前主要用于測定跨膜Ca2+的流動。
優點：測量方法簡單易行，比普通化學分析法的靈敏度高。確定放射性示蹤劑在組織器官內的定量分布，可以達到細胞、亞細胞乃至分子水平。
缺點：靜態效果差，需要特定的同位素測定儀，并且要注意示蹤劑的同位素效應和放射效應問題。
 

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核磁共振法：是一種新的、非光學技術的Ca2+檢測方法。由于正常生物體內氟含量很少，為了得到足夠的響應，在檢測時需要使用含氟指示劑。該指示劑經過化學修飾后進入細胞，進而被水解成游離狀態，然后與Ca2+結合，根據獲得的波譜圖計算出Ca2+的濃度。
優點：具有非破壞性和無損傷性，能夠在接近生物樣本生理狀態下連續動態地進行檢測，準確反應Ca2+濃度。
缺點：需要核磁共振儀，成本較高。

 

熒光探針法：目前常用的Ca2+熒光探針有Fluo-3、Fluo-4、Fluo-８等。這類探針本身無法進入細胞，但它的親脂性衍生物卻可以透過細胞膜進入細胞。一旦進入細胞，這類親脂性衍生物的親脂性封閉基團在細胞非特異性酯酶的作用下被分裂除去，在細胞內便會形成一種帶負電荷的熒光染料。與胞內Ca2+結合時，其熒光強度顯著增加。
優點：指示劑易導入細胞，空間分辨率高，反應速度快，而且可同時檢測多重離子。
缺點：需要有熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡，成本較高。

 

 

水母發光蛋白檢測法:  最近十幾年來，水母發光蛋白(Aequorin)很受人們的關注。水母發光蛋白由189個氨基酸組成，具有3個Ca2+結合的EFhand結構，所以水母發光蛋白可作為檢測Ca2+的新型探針。
優點：Ca2+/水母蛋白復合物能檢測~0.1μm到＞100μm范圍內的鈣離子濃度，且復合物不會從細胞內泄露出來，可檢測幾小時至數十天內Ca2+濃度的變化。比熒光探針法的背景低，樣本本身不會發生自熒光。

 

00000000腔腸素的性質00000000

腔腸素(Coelenterazine)作為海洋動物體內貯存光能的分子，它廣泛存在于海洋生物體內，比如海腎、海蜇、水螅等。腔腸素是天然熒光素中最普遍的，它可作為很多熒光素酶的底物。目前研究得最透徹的以腔腸素為底物的熒光素酶來源于海腎（Renilla），即海腎熒光素酶（Renilla reniformis，簡稱Rluc）。

腔腸熒光素是一個分子量約400 Da 的疏水基團，它可以自由穿越細胞膜。在一個以熒光素/熒光素酶為基礎的系統中，腔腸素作為以水母發光蛋白為代表的海洋發光蛋白的輔助因子，與水母發光蛋白進行穩定的結合，引起脫輔基水母發光蛋白和腔腸熒光素之間的共價鍵破裂，腔腸熒光素(Coelenterazine)被氧化脫羧，形成腔腸酰胺（Coelenteramide），釋放出CO2，同時發出波長為469nm的藍色生物熒光，該熒光可用博鷺騰高靈敏度管式/板式發光檢測儀進行測定。
 

圖1.腔腸素/水母發光蛋白檢測Ca2+機制
 

  由于Ca2+在生命活動的各種生理生化反應、疾病的發生和發展中都扮演著極其重要的角色，而游離的Ca2+濃度變化又與細胞的功能、信號轉導乃至細胞的凋亡有密不可分的聯系，因此，研究如何檢測細胞內游離Ca2+濃度顯得尤為重要。