Jennifer Rottenberger¹, Paul Monnier², Maria Milla², Tobias Beyer², Dario Ossola², Justin S Antony¹ and Markus Mezger¹
1 University Children's Hospital, Department of Pediatrics I, Hematology and Oncology, University of Tübingen, Tübingen, Germany
2 Cytosurge AG, Saegereistrasse 25, 8152 Glattbrugg, Switzerland
 

生物制藥和生物學研究以及生物制品的生產制造都依賴于基因修飾的細胞系，這些細胞系的基因被修飾，以誘導所需的表現型。隨著CRISPR等基因編輯技術的發現和發展，多位點編輯的越來越引起了研究者的重視，但實際研究表明，整個實驗進程是冗長而復雜的過程。近期，來自德國圖賓根大學附屬兒童醫院的學者和來自瑞士Cytosurge公司工程師合作，通過FluidFM BOT技術手段，在不到三周的時間內完成了多基因敲除的單克隆細胞系。

FluidFM BOT助力CRISPR實現新突破

自CRISPR作為一種基因編輯技術被發現和發展以來，它已經徹底改變了許多生命科學的研究領域。它為科學家提供了一種高度通用的基因工程工具，已經應用于各種廣泛的生物體�？茖W家們對多基因位點編輯的多重策略的興趣也正在急劇的增加：多重gRNAs的使用可以大大的增強CRISPR的應用范圍。如多位點基因編輯，基因失調，細胞凋亡等。

用傳統技術手段包括轉染等方法將多個gRNAs傳遞到細胞中極具挑戰。除了由幾次DNA雙鏈斷裂引起的DNA損傷反應外，細胞活力也可能因物理損傷和化合物進入細胞核所引起的毒性而大大降低。所有這些都極大地限制了CRISPR多位點編輯的潛力和效率。

FluidFM BOT技術獨具，可將化合物直接的輸送到任何細胞的細胞核中(圖1)。因此，所有的試劑可以調整為最佳的配比劑量進行注射，這樣的話就最大限度地提高了效率，降低了細胞所受的物理壓力，同時也減少了脫靶效應。FluidFM BOT技術完全屏蔽了常規基因遞送方法的障礙，甚至CRISPR RNP復合物可以與數十甚至數百種不同的gRNAs共同注射。此外，FluidFM BOT的注射物不依賴于待注射物本身的特性，對于難以轉染的細胞(如原代細胞)或需要大量的基因插入和沉默時候更具獨特優勢。

圖1：FluidFM BOT技術可以溫和地操作單個細胞。

在傳統的細胞系發展系統實驗中，為了得到穩定轉染的細胞系，候選細胞系在增殖過程中被反復評估。目前需要的時間是12到14周。相比之下，通過FluidFM BOT技術可以挑選一個BOT注射編輯過的單個細胞，并從中產生克隆體——從轉染之日起直到克隆體被鑒定出來，不到三周的時間。大大提高了細胞系構建的時間。

FluidFM BOT技術進行多基因敲除構建細胞系

接下來，我們將展示了如何使用FluidFM BOT技術在不到三周的時間內生成單克隆多敲除細胞系(圖2)。首先，通過FluidFM BOT技術將外源物注射到CHO細胞中，同時靶向幾個不同基因的基因組位點，直接將gRNA/Cas9 RNP復合物導入細胞核。納米注射后，記錄每個轉染細胞的位置，這樣以便在注射24小時后使用FluidFM BOT探針進一步分離成功轉染的細胞。然后將這些細胞擴展成單克隆細胞系。接下來對細胞進行測序，以確定基因編輯是否成功。
 

圖2：FluidFM BOT技術進行細胞株開發流程：第1天，細胞經FluidFM BOT注射轉染。第2天，選擇成功轉染的細胞，通過FluidFM BOT系統進一步進行單細胞分離。從第3天到第14天，分離的單細胞擴展成穩定的單克隆細胞系，并對其基因組進行分析。
 

第1天：FluidFM BOT單細胞注射轉染

通過FluidFM BOT技術進行納米注射，簡單的點擊鼠標即可完成對幾十個CHO細胞的細胞核進行精準注射，以大約5個細胞/分鐘的速度自動完成注射。熒光標記物與所有不同的gRNA/Cas9 RNP復合物共注射，以方便監測注射過程并識別最佳候選復合物(圖3)。
 

圖3：FluidFM BOT注射CRISPR/Cas9復合物和熒光標記物的CHO細胞的熒光圖像。
 

第2天：FluidFM BOT進行單細胞分離和分選

FluidFM BOT對細胞進行了注射轉染24小時后，使用集成FluidFM BIO系列操作軟件(ARYA)可以再次精確的找到所有目標細胞。進而，進行FluidFM BOT進行單細胞分離和分選，將目標單細胞采用孔徑為4 μm的FluidFM探針進行單分離，放入空的孔板中(圖4)。從視覺角度可以完全確保細胞系的單克隆性。
 

圖4：明場成像可以完全確保細胞系的單克隆性。
 

第3 - 14天：單克隆細胞的擴增和突變分析

分離后培養克隆，并在3天和6天后監測其生長情況(圖5.1和5.2)。90%以上的分離細胞發育成一個細胞群落。轉染后14天，收集克隆并對目標基因進行測序分析。50%的克隆在靶向位點上顯示突變。

圖5.1：分離3天后的12組CHO細胞集落。

圖5.2：單克隆細胞群落生長6天后

結論
結果表明，通過FluidFM BOT技術對單個細胞進行注射，完成了多個gRNAs同時遞送到選定的單個細胞中這一艱難的任務。采用FluidFM BOT技術方法進行的CRISPR細胞編輯技術，同時共注入幾十種gRNAs所獲得的細胞系可以進一步擴增。此外，我們在這里證明了FluidFM BOT技術的使用大大減少了多表型單克隆細胞系的開發時間，從數月減少到三周。

展望
FluidFM BOT技術為單細胞基因工程領域帶來了全新的突破，有潛力解決科學家目前面臨的一些艱巨的挑戰，尤其是在他們需要快速和有效地開發單克隆細胞系時。傳統的方法完全適用于最常見的細胞系和基因工程策略，但當處理不常見的、罕見的或脆弱的、和已知難以轉染的原代細胞類型，或者需要復雜的實驗設計——例如CRISPR多基因編輯時，傳統的方案就非常受限制。在這些特殊情況下，FluidFM BOT技術可能是僅有的可用的解決方案。

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