文章導讀
近年來，eccDNA（染色體外環狀DNA）連登《Nature》《Cell》等期刊，徹底顛覆了人們對基因遺傳的傳統認知(顛覆性發現：癌基因竟不在染色體上 環狀DNA連登Nature，Cell！)，成為了極具潛力的科研新熱點（2020國自然研究熱點—eccDNA的前世今生）。
近期，NIPT之父盧煜明教授基于轉座酶和m5C位點酶學轉化方法開發出了eccDNA甲基化測序技術，并揭示了孕婦血漿中的胎兒eccDNA甲基化狀況，為eccDNA的深入研究及新型分子標志物的開發提供了新的技術手段。
作為國內提供eccDNA測序服務的公司，云序生物一直是eccDNA領域的領跑者。通過嚴謹的技術開發和質控，云序再次全國首發：eccDNA甲基化測序服務（全國首發！云序再推eccDNA重磅新品：eccDNA甲基化測序！）！
我們就為大家解讀這篇eccDNA甲基化的文章，以及介紹云序生物eccDNA甲基化測序及相關產品。 發表雜志：Clinical Chemistry
影響因子：7.292
發表日期：2021.2
文章鏈接：Characteristics of Fetal Extrachromosomal Circular DNA in Maternal Plasma: Methylation Status and Clearance

文章內容

1. eccDNA甲基化鑒定實驗方法
作者采集了產后不同時間點的母體血漿，使用限制性外切酶對其中的eccDNA進行了純化富集，然后構建了5-mC-Tn5轉座子將eccDNA剪切成線性分子。通過酶處理使未發生5mC甲基化的C轉化為U，再進行建庫及高通量測序，分析得到eccDNA上發生甲基化的位點。
2. eccDNA和甲基化位點的分布
作者展示了血漿eccDNA的長度分布集中在202bp和338bp左右，胎兒來源的eccDNA比母體來源的eccDNA長度更短，甲基化密度更低。基因和基因間來源的EccDNA上CpG島甲基化密度無顯著差別，線性DNA和eccDNA的甲基化密度也未發現明顯差別。另外，作者還用了對5mC敏感和不敏感的兩種限制性內切酶驗證了胎兒來源的eccDNA甲基化程度比母體來源eccDNA低。  
3. eccDNA長度與甲基化密度的關聯
作者分析測序數據發現，小分子eccDNA的甲基化密度低于長分子eccDNA。通過MspI/HpaII消化實驗驗證了這一趨勢。
4. 胎兒eccDNA在母體循環中的清除
在分娩后0,30,60,120分鐘分別采取母體血漿，測序發現胎兒來源的eccDNA和線性DNA占比迅速降低，兩者的半衰期相似。
云序生物eccDNA甲基化測序
eccDNA大量存在與正常體細胞和癌細胞中，其上染色質高度開放，攜帶基因能夠大量表達，可以影響細胞生命活動，在腫瘤發生發展機理研究中發揮著重大的潛在價值，并且可能成為一種新型特異的腫瘤標志物。而DNA甲基化又能控制基因表達，在動植物的生長發育過程中發揮著關鍵的調控作用，并且與多種人類疾病密切相關，是表觀遺傳學研究的熱點。
云序生物作為追逐不斷創新的科技創新型企業，在推出eccDNA測序的基礎上，再次推出eccDNA甲基化測序服務，助力探索研究熱點。

技術優勢：

一箭雙雕：同時檢測eccDNA及其甲基化狀況，節約樣品，性價比高
單堿基分辨的eccDNA甲基化分析

實驗流程

1. EccDNA富集：通過核酸外切酶 V 消化等手段，去除樣品中的線性DNA，從而達到富集eccDNA的目的。
2. 加接頭：通過轉座酶打開eccDNA的環形結構，并在DNA片段的兩端加上接頭。
3. 末端修復：通過Klenow酶修復轉座產物的末端缺口。
4. C-U轉化：通過溫和的酶轉化法，將未甲基化的胞嘧啶（C）高效地轉化為尿嘧啶（U）。
5. PCR擴增：對轉化后產物進行PCR擴增及純化。
6. 上機測序：純化后文庫質檢合格后進行上機測序。
云序eccDNA甲基化測序實例展示
實驗項目：血漿eccDNA甲基化測序
A. 質控
1. 血漿cfDNA Qubit定量
通過Qubit熒光定量儀檢測摻入樣品DNA的特異熒光染料信號，從而對樣品進行精確定量。
2. 文庫2100質控
通過Agilent生物分析儀對測序文庫進行質控。

3. FastQC質控
通過FastQC軟件進行測序數據質控。

 

4. Read統計及轉化率
對測序堿基質量(Q30)，Read及C-U轉化率進行統計。
B. 數據展示
1. eccDNA的識別及甲基化水平
通過軟件識別eccDNA的染色體坐標，長度及表達量 ecc_chr: eccDNA的染色體
ecc_start: eccDNA的起始位點
ecc_end: eccDNA的終止位點
ecc_location: eccDNA的染色體坐標
ecc_length: eccDNA的長度
T1，T2: 不同樣品中某個eccDNA對應的原始split reads數目
Meth_Level_T1,T2: 不同樣品中某個eccDNA的甲基化水平

2. eccDNA的基因注釋
對eccDNA所在位置的蛋白編碼基因的位置，基因名，基因ID等信息進行注釋
chr, start, end: eccDNA所在區域的蛋白編碼基因的基因組位置信息
gene_id: eccDNA所在區域的蛋白編碼基因的gene ID
gene_name: eccDNA所在區域的蛋白編碼基因的基因名
strand: eccDNA所在區域的蛋白編碼基因所處的正負鏈信息
overlap: eccDNA與蛋白編碼基因的重疊區域

3. eccDNA長度分布圖
eccDNA的長度分布圖表明：eccDNA在兩個區域富集，一是~200bp的區域，另一個是300-450bp的區域。
4. eccDNA甲基化水平統計
不同功能區域的eccDNA的甲基化水平統計 eccDNA甲基化測序樣品要求：
cfDNA: > 50 ng
血漿：> 5 mL
細胞：> 2 x 107
組織：> 100 mg
其他樣品類型咨詢021-64878766當地銷售

云序生物eccDNA
1. 組織細胞eccDNA測序
基于circle-seq方法,利用A&A Biotechnology離子交換柱高效富集基因組DNA中的eccDNA，利用核酸酶消化除去殘余線性DNA, 通過滾環擴增獲得大量的eccDNA拷貝,再利用NGS測序高通量地檢測樣品中所有的環狀DNA分子。
2. 血清血漿eccDNA測序
利用Tn5轉座酶打開環狀結構，高效檢測循環系統中微量的eccDNA分子。
3. eccDNA甲基化測序
利用Tn5轉座酶打開環狀結構，用酶轉化法將未甲基化的胞嘧啶（C）高效地轉化為尿嘧啶（U）。實現單堿基分辨率的eccDNA甲基化檢測
4. eccDNA sanger測序驗證
針對eccDNA的連接位點設計反向引物，PCR后sanger測序驗證連接位點處序列。