細胞培養實驗室中生物污染的來源、分類和消除方法
摘要
污染是科學家在細胞培養實驗室工作中最擔心的情況之一。細胞培養的生物污染幾乎始終與實驗次數、項目延期有關，有時候甚至和實驗室關閉或損失了稀缺的細胞有關，導致浪費了寶貴的時間和資源。
圖 1：細胞培養中污染物的大小范圍從 100µm 到 50nm 不等，傳統的光學顯微鏡很難觀察到最小的污染物（病毒和支原體）。
通常，有許多生物體在細胞培養物內造成污染。它們包括：
污染是科學家在細胞培養實驗室工作中最擔心的情況之一。細胞培養的生物污染幾乎始終與實驗次數、項目延期有關，有時候甚至和實驗室關閉或損失了稀缺的細胞有關，導致浪費了寶貴的時間和資源。
圖 1：細胞培養中污染物的大小范圍從 100µm 到 50nm 不等，傳統的光學顯微鏡很難觀察到最小的污染物（病毒和支原體）。
- 細菌
- 真菌
- 病毒
- 酵母菌
- 支原體
- 真核細胞
這些污染物的表現方式各不相同，因此，需要不同的預防、檢測和清除策略。真菌、細菌和酵母菌隨著細胞一起快速生長，它們產生的污染不管是在宏觀上還是微觀上都很容易檢測到。支原體和病毒會感染細胞，但是由于它們太小很難直接檢測。真核細胞的污染常常表現為快速生長的細胞，用顯微鏡明顯可見，但是很難把它們和培養細胞區分開來，并且它們會逐漸取代培養物 [1]。
實驗室的污染來源也同樣廣泛。有時候，污染物在細胞進入實驗室時就已經存在；這種情況最常見的是難以檢測的污染物，如真核細胞和支原體。細胞培養基等試劑是另一種來源，特別 是內部制備和消毒的、多人使用的或是過期使用的。耗材也很 可能藏匿污染物，所以細胞培養時強調只使用一種無菌耗材的重要性。最后，無菌操作技術使用的疏忽也會引起污染。
在和污染的斗爭中，研究人員十分注重預防，因為“ 防患勝過補救 ”。現在，許多防范措施是細胞培養實驗室的標準操作規范，比如高壓滅菌器消毒、使用預先制備的和預先消毒的培養基、無菌技術的培訓、定期支原體檢測以及往細胞培養基中添加抗生素。然而，后者在現代細胞培養中不太普遍使用，因為科學家們愈發意識到抗生素會影響細胞的生長和行為，因此偏向使用無抗生素培養基。
可是，即使實驗室里采取最嚴苛的預防措施，仍然有很小的污 染風險影響細胞培養。如果發生這種情況，必須迅速采取行動， 并且按照針對這些情況制定的規程應對。盡管不同實驗室的規程大不相同，但使用實驗室的人采取的大多數行動都屬于此處討論的四個方面：
- 清除
- 確定污染程度
- 找出原因
- 后續執行
清除
為了防止污染在實驗室內擴散或是再次發生，發現污染后最緊急的做法是進行徹底清除。細菌、酵母菌和真菌孢子會急速擴 散，常常無人注意，直到感染了其他培養基甚至是其他實驗室。
清除的基本方面是追溯做過的步驟。即使是快速生長的污染物也需要一定時間才能生長到能檢測出的水平，這意味著當污染物能在肉眼或顯微鏡下可見時，很可能它在培養基中已經超過24 小時了。為此，重要的是要快速確定過去幾天和感染的培養基接觸過的所有區域、基質、試劑和人。
首先，感染的培養器皿（多孔板、T 型培養瓶和培養皿）應經過高壓蒸汽處理或消毒，然后丟棄。建議高壓蒸汽處理所有的培養器皿，因為這種方法安全可靠，可確保無殘留污染物遺留在培養器皿上。然后，按照正確的生物樣品處置途徑處置。
其次，清理感染的培養箱和生物安全柜。清理培養箱時，所有其他的培養物應提前移開，可是為了避免可能的更大程度污染， 建議勿將培養物移到其他培養箱里培養。如有可能，將所有培養物暫時移進生物安全柜或另一個培養箱，完成清理后放回原來的培養箱。
選擇一種消毒劑，它對存疑的污染物都有效，并且與使用的物料都適合，這點很重要。許多情況下，使用酒精消毒劑（70% 酒精或異丙醇）進行日常清潔就很適合，但是某些情形可能需要用到其他的替代清潔劑（見表 1）。此外，有些培養箱有自動消毒功能，例如使用高溫，有助于快速便捷凈化污染后的培養箱（圖2）。有些培養箱甚至可能設置自動提醒程序，確保定期清潔消毒設備。
清除的基本方面是追溯做過的步驟。即使是快速生長的污染物也需要一定時間才能生長到能檢測出的水平，這意味著當污染物能在肉眼或顯微鏡下可見時，很可能它在培養基中已經超過24 小時了。為此，重要的是要快速確定過去幾天和感染的培養基接觸過的所有區域、基質、試劑和人。
首先，感染的培養器皿（多孔板、T 型培養瓶和培養皿）應經過高壓蒸汽處理或消毒，然后丟棄。建議高壓蒸汽處理所有的培養器皿，因為這種方法安全可靠，可確保無殘留污染物遺留在培養器皿上。然后，按照正確的生物樣品處置途徑處置。
其次，清理感染的培養箱和生物安全柜。清理培養箱時，所有其他的培養物應提前移開，可是為了避免可能的更大程度污染， 建議勿將培養物移到其他培養箱里培養。如有可能，將所有培養物暫時移進生物安全柜或另一個培養箱，完成清理后放回原來的培養箱。
選擇一種消毒劑，它對存疑的污染物都有效，并且與使用的物料都適合，這點很重要。許多情況下，使用酒精消毒劑（70% 酒精或異丙醇）進行日常清潔就很適合，但是某些情形可能需要用到其他的替代清潔劑（見表 1）。此外，有些培養箱有自動消毒功能，例如使用高溫，有助于快速便捷凈化污染后的培養箱（圖2）。有些培養箱甚至可能設置自動提醒程序，確保定期清潔消毒設備。
圖 2：針對在 180℃ 條件下對 CO2 培養箱進行消毒之前的標準化清潔程序，提供清晰的說明指導步驟，進一步減少用戶操作失誤的可能，還應使用可耐受高溫的傳感器。
表1：常用實驗室消毒劑的優缺點（改編自[2]）
只要正確使用生物安全柜，每次使用后有效清潔，那么不同使用者的培養物間傳染物的傳播風險就低（圖3）。但是， 如果有任何跡象表明安全柜仍遺留有污染物，例如來自同一安全柜的重復感染，強烈推薦再另外使用酒精等消毒劑徹底清潔。雖然建議在日常維護中對生物安全柜進行熏蒸，但除非有特殊情況，否則無需進行熏蒸以控制污染[3]。
圖3：在細胞培養工作中，研究人員可以按照潔凈和臟污的材料劃分工作空間，從而降低污染的風險。
最后，需要清理可能攜帶污染物的其他設備或工具，如水浴搖床和移液管。盡管在現代的細胞培養中，大多數接觸細胞和培養基的材料是一次性使用的，但最好檢查一下所有可能受到污染的物品是否已丟棄、經過高壓蒸汽處理（如可能），或是另外消毒。
挽救稀有的培養物
絕大多數的污染情況會要求受污染的培養物做高壓蒸汽處理然后立即丟棄。但是，可能有培養物十分稀缺的情況。在這種情況下，研究人員可能要準備好花費大量的時間和資源嘗試“ 拯救 ”被污染的培養物。能否成功取決于污染的性質和程度。此外，重要的是了解這些方法有無可能對潛在的細胞有重大的、而且往往是永久的影響，例如應激信號級聯的激活 [4]。
當一種細胞培養物受到快速生長的真核細胞一類的污染，比如 HeLa 或 HEK293 細胞系，有限稀釋可能是一種處理選擇。按低或甚至是單細胞密度稀釋并完成細胞鋪板可以幫助獲得極少量但很純凈的培養物，然后可培養繁殖并測試，比如使用短串聯重復序列分析（STR 分析）。
如果一種培養物受到了支原體的污染，有許多將其從培養細胞移除的方法可試。
盡管常用的抗生素（如盤尼西林和鏈霉素）無法殺死支原體，但也有可用的抗生素，比如四環素、大環內酯類和喹諾酮。然而，大多數用于去除支原體的抗生素制劑都存在強細胞毒性，通常需要進行數周進行處理 [5]。
其他類型的污染，如細菌和真菌，向培養基快速釋放毒素，可以永久性地改變所有存活細胞的行為和代謝。這意味著從污染過的培養物取得的所有結果，其可靠性和復現性是存在質疑的。然而，有些制造商提供的抗生素和抗真菌劑，結合廣泛的清洗和重新鋪板過程，可能會去除早期的感染。雖然如此，因為細胞污染的負作用和進一步擴散的可能，這種方法不怎么建議使用。
絕大多數的污染情況會要求受污染的培養物做高壓蒸汽處理然后立即丟棄。但是，可能有培養物十分稀缺的情況。在這種情況下，研究人員可能要準備好花費大量的時間和資源嘗試“ 拯救 ”被污染的培養物。能否成功取決于污染的性質和程度。此外，重要的是了解這些方法有無可能對潛在的細胞有重大的、而且往往是永久的影響，例如應激信號級聯的激活 [4]。
當一種細胞培養物受到快速生長的真核細胞一類的污染，比如 HeLa 或 HEK293 細胞系，有限稀釋可能是一種處理選擇。按低或甚至是單細胞密度稀釋并完成細胞鋪板可以幫助獲得極少量但很純凈的培養物，然后可培養繁殖并測試，比如使用短串聯重復序列分析（STR 分析）。
如果一種培養物受到了支原體的污染，有許多將其從培養細胞移除的方法可試。
盡管常用的抗生素（如盤尼西林和鏈霉素）無法殺死支原體，但也有可用的抗生素，比如四環素、大環內酯類和喹諾酮。然而，大多數用于去除支原體的抗生素制劑都存在強細胞毒性，通常需要進行數周進行處理 [5]。
其他類型的污染，如細菌和真菌，向培養基快速釋放毒素，可以永久性地改變所有存活細胞的行為和代謝。這意味著從污染過的培養物取得的所有結果，其可靠性和復現性是存在質疑的。然而，有些制造商提供的抗生素和抗真菌劑，結合廣泛的清洗和重新鋪板過程，可能會去除早期的感染。雖然如此，因為細胞污染的負作用和進一步擴散的可能，這種方法不怎么建議使用。
確定污染程度
在清除后，甚至在清除時，有必要對污染程度進行評估，確認是否超出可接受程度。實驗室成員間的溝通對此起到關鍵作用。實驗室成員無論何時發現污染，都必須告知實驗室責任管理人，他們可告知其他可能受影響的實驗室使用者，并對之后的行動給出建議。這對大型公共平臺來說尤其重要。
在確定污染程度時，最需要了解的是，一種類型的污染物可以以不同的速度在不同的時間污染培養物。這意味著，當一種培養物出現污染，其他培養物也可能有已經出現相同污染的風險，例如，同樣的培養基污染多個培養瓶或細胞系⸺即使還未到可見的程度。
為此，必須對所有可能受到污染的培養物進行徹底檢查，避免忽略低程度的污染物，然后對其進行隔離（如有可能）。這些措施應持續幾天，避免有生長緩慢的生物體。至于支原體檢測，觀察活細胞的標準顯微鏡不太可能發現污染，因為其太小，這意味著有必要使用 PCR 進行檢測。
找出原因
在采取所有控制污染傳播的措施后，有時候任務的困難之處在于查明原因。盡管許多污染的例子是一次性的事件，比如不恰當無菌技術的后果，但還有許多其他情況是外部感染造成的，將來有可能還要感染其他培養物。為此，尋找源頭的措施應立刻進行，并且務必徹底，且應由整個團隊共同尋找，而非僅憑個人努力。
第一個需要問的問題是：有模式嗎？是否有些培養物受污染了而有些沒有，這可能是潛在源頭的線索，可以是很小、容易忽視的細節（圖 4）。如果整個實驗室出現了這種問題，更可能是系統性的原因，比如通風管道、濾器問題、高壓滅菌器問題等。
圖4：細胞培養中的污染可能存在許多不同的源頭。尋找一個模式可以有助于識別源頭
另一個有用的問題是：有什么改變？實驗室，特別是科研實驗室，可能缺乏某些規范和標準操作程序，所以仔細檢查實驗室日志，看看最近采取的方法、采用的供應商和設備變化，是找到原因的另一個好方法。
不管原因是否出在培養基和試劑上，建議丟棄曾發生污染培養物的低價值儲備溶液。這是因為污染有可能已經從培養物擴散到儲備溶液里了。對于高價值儲備溶液，應進行徹底的無菌檢查，確保可以安全使用。做法是在 T 型培養瓶中培養樣品，并將培養瓶放在隔離培養箱隔離（圖 5）。
對原種進行檢測是另一種例行程序，可以用來發現污染的原因，特別是當培養物剛剛從液氮原液中恢復活力。檢測方法是另外從原種中凍融并鋪板一小瓶培養物，檢查是否存在污染。如果存在污染，應該從之前的流程或使用新購買的儲備液重新開始培養。極少情況下，供應的原種就已經有污染，物應盡快聯系供應商告知他們所遇到的問題。在聯系供應商時，盡可能獲取污染產品的信息很重要（準確的產品名稱、產品號、批號等等），以便盡快解決所有的生產問題或物流問題。為了確保此批號始終可追蹤，有必要在等分樣時在每份樣品上標記批號。
執行這些操作后就無需使用常規的抗生素，還可確保培養的細胞準確地代表了一種自然表型或疾病狀態。
圖5：隔離培養箱是限制污染傳播的一個好方法，也能挽救可能未受污染的細胞和試劑。
后續執行
在所有的污染痕跡都被清理干凈，原因也被確定之后，有助于防止未來發生污染的最后一步是檢查是否需要做出任何整改措施？當問題可能來自于試劑或耗材時，著重檢查所有物品是否從信譽良好的供應商處購買，是否無菌，是否屬于細胞培養級別的物料，以及是否采用合適的方法運輸、保存物料。
當污染很可能是因為操作失誤發生時，檢查并更新現有的規程可以幫助避免未來遇到這類問題。重要的是知曉錯誤可以在任何地方發生，以及對規程的簡單調整，例如關鍵步驟加上警示，可以幫助防止錯誤。另外，用戶培訓有助于改善無菌工作效果，減少污染。
保存準確、詳細的記錄對任何實驗室都是至關重要的，無論如何，查找污染原因有時可以發現保存記錄中的問題。一次污染事件恰好可以成為一個契機，以確保整個實驗室的操作人員以準確、標準的方式保存記錄。
盡管抗生素對防止污染有潛在的好處，但不建議在細胞培養中例行使用抗生素。許多抗生素顯示它們對細胞增殖和代謝有影響 [6]。當細菌污染不斷發生時，有限使用抗生素有助于減少污染風險。然而，預防細胞培養物污染通常應通過培訓和遵循良好的實驗室管理規范實現。
當污染很可能是因為操作失誤發生時，檢查并更新現有的規程可以幫助避免未來遇到這類問題。重要的是知曉錯誤可以在任何地方發生，以及對規程的簡單調整，例如關鍵步驟加上警示，可以幫助防止錯誤。另外，用戶培訓有助于改善無菌工作效果，減少污染。
保存準確、詳細的記錄對任何實驗室都是至關重要的，無論如何，查找污染原因有時可以發現保存記錄中的問題。一次污染事件恰好可以成為一個契機，以確保整個實驗室的操作人員以準確、標準的方式保存記錄。
盡管抗生素對防止污染有潛在的好處，但不建議在細胞培養中例行使用抗生素。許多抗生素顯示它們對細胞增殖和代謝有影響 [6]。當細菌污染不斷發生時，有限使用抗生素有助于減少污染風險。然而，預防細胞培養物污染通常應通過培訓和遵循良好的實驗室管理規范實現。
總結
污染對所有細胞培養實驗室都是一個持續風險。盡管預防是減少污染煩擾的關鍵，但在狀況發生時，快速徹底且系統地行動在限制污染所造成的后果上是有幫助的。
盡管每個實驗室處理污染會有不同的程序，但總體來說，分文概括的步驟對于最大限度減少污染的干擾，幫助實驗室有效運作提供了一個好的開始。
參考文獻
1. Neimark J. Line of attack. Science 2015; 347: 938–940.
2. Geraghty RJ et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer 2014: 1–26.
3. Kennedy DA and Collins CH. Microbiological Safety Cabinets: Selection, Installation, Testing and Use.
British Journal of Biomedical Science 2000; 57(4): 330–7.
4. Ji Y et al. Mycoplasma Infection of Cultured Cells Induces Oxidative Stress and Attenuates Cellular Base Excision Repair Activity. Mutation Research 2019; 845.
關于 Eppendorf
Eppendorf 是一家領先的生命科學公司，專注于研發和銷售實驗室的液體處理、樣品處理和細胞處理的儀器、耗材和服務。主要產品包括移液器、自動移液系統、分液器、離心機、混勻儀和分光光度計、 PCR 儀，以及超低溫冰箱、發酵罐、生物反應器、二氧化碳培養箱、生物搖床和細胞顯微操作系統。相關耗材，如移液器吸頭、離心管、微量工作板和一次性生物反應器，為高質量的工作流程解決方案提供幫助。
盡管每個實驗室處理污染會有不同的程序，但總體來說，分文概括的步驟對于最大限度減少污染的干擾，幫助實驗室有效運作提供了一個好的開始。
參考文獻
1. Neimark J. Line of attack. Science 2015; 347: 938–940.
2. Geraghty RJ et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer 2014: 1–26.
3. Kennedy DA and Collins CH. Microbiological Safety Cabinets: Selection, Installation, Testing and Use.
British Journal of Biomedical Science 2000; 57(4): 330–7.
4. Ji Y et al. Mycoplasma Infection of Cultured Cells Induces Oxidative Stress and Attenuates Cellular Base Excision Repair Activity. Mutation Research 2019; 845.
關于 Eppendorf
Eppendorf 是一家領先的生命科學公司，專注于研發和銷售實驗室的液體處理、樣品處理和細胞處理的儀器、耗材和服務。主要產品包括移液器、自動移液系統、分液器、離心機、混勻儀和分光光度計、 PCR 儀，以及超低溫冰箱、發酵罐、生物反應器、二氧化碳培養箱、生物搖床和細胞顯微操作系統。相關耗材，如移液器吸頭、離心管、微量工作板和一次性生物反應器，為高質量的工作流程解決方案提供幫助。
Eppendorf 于 1945 年在德國漢堡成立，在全球擁有 3,600 多名員工。公司目前在 26 個國家設立了子公司，并在其他市場設立銷售體系。 隔離和檢疫 CO2 培
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