腺相關病毒（Adeno-associated virus, AAV）是一種常用的工具病毒，因其具有低免疫原性、高安全性及感染宿主范圍廣等特點，被廣泛應用于各種體內研究，例如，將攜帶有特定基因序列的AAV注射至小鼠體內，實現目的基因的過表達、敲低或敲除。近年來，基因治療領域發展迅速，無論是基礎研究還是產業轉化都取得了重大突破，而AAV是基因治療最重要的一種遞送載體。據統計，目前正在進行的基因治療臨床試驗中，AAV占了所有病毒載體的一半以上。這除了AAV具有體內安全性高的優勢外，還有個很重要的因素是，AAV具有良好的組織特異性。

基因的表達具有組織特異性，即同一基因在不同種類的組織或細胞中表達存在差異。在我們進行基因功能研究時，常需要在小鼠體內對目的基因進行組織特異性調控，即在特定的組織或細胞中表達外源序列而不影響其他組織。

那么，通過AAV實現體內特異性調控要怎么做呢？常見的有4種策略：通過原位注射、組織特異性血清型、特異性啟動子和Cre-loxp系統，下面就來給大家一一介紹。

原位注射
原位注射，顧名思義就是直接將AAV注射到想要表達的組織中，如腦立體定位注射、肌肉注射、心肌注射等。原位注射可讓AAV對目標組織快速感染，并很少擴散至全身，從而降低對其他正常組織器官的影響。但可進行原位注射的組織要求是足夠厚實的實質組織或相對封閉的腔間隙，因此目前能進行AAV原位注射的組織類型并不多，而且像腦立體定位注射、玻璃體腔內注射等原位注射具有較高的操作門檻。

目前常用組織原位注射方式如下表所示：
 

表1. 不同組織原位注射方式[1]

組織特異性血清型
AAV的血清型主要由AAV衣殼蛋白的結構所決定，不同的衣殼蛋白結構識別不同的細胞表面受體，因此不同血清型的AAV會影響其感染效率、組織親和性以及開始表達的時間等。
 

表2. 部分AAV組織特異性血清型[2]

從上表可看出，目前AAV的血清型種類并不多，因此科學家也在積極地對AAV衣殼蛋白進行改造，開發出更多的、對特定組織感染能力更強的血清型AAV。例如，研究人員開發出了一種可用于耳聾基因治療的AAV新變體，命名為AAV-ie（AAV-inner ear），其能夠高效靶向小鼠內耳組織，且在內耳支持細胞上表現出比AAV1、AAV6、AAV8、AAV-DJ等血清型具有更高的感染效率。
 

圖1. AAV-ie能高效感染耳蝸支持細胞[3]

組織特異性啟動子
雖然不同血清型AAV對不同組織的感染具有傾向性，但仍難避免感染其他非靶向組織，這時候便需要利用多種組織或細胞特異性啟動子來提高AAV的特異性。組織特異性啟動子是指在該啟動子調控下，外源基因一般只在某些特定的器官或組織部位表達。Bilal等采用Cre重組酶雙熒光報告基因小鼠（mT/mG）作為實驗動物，研究NPPA和Myl2啟動子在心臟腔室特異性活性，最后將AAV9基因特異性表達載體應用在心臟腔室中進行基因特異性表達研究，促進人們對心臟病的了解，有助于心臟病基因療法的開發。
 

圖2. Nppa和Myl2啟動子插入表達Cre的AAV9載體中[4]

Cre-loxp系統
除此之外，基于Cre-loxp系統的AAV和工具小鼠聯用方案也被越來越多的應用。Cre是一種重組酶，可以識別催化兩個Loxp位點之間的片段發生同源重組，并根據兩個loxp位點的方向，造成DNA的缺失、易位等現象。從而實現目的基因的基因敲除、序列翻轉以及基因轉座。

因此，我們可向Cre小鼠中注射含loxp位點的AAV，從而在小鼠體內實現目的基因過表達或干擾表達；同樣，我們可向含loxp位點的flox小鼠中注射可表達Cre的AAV，從而實現目的基因的敲除。

Sun等使用 Cre-loxp系統注射到小鼠VMH（腹內側下丘腦）中，特異性敲除初級纖毛相關基因，并觀察到了小鼠的代謝失調和骨骼穩態異常，從而證實其在調節能量和骨骼穩態中具有至關重要的作用。
 

圖3. VMH特異性初級纖毛KO小鼠骨骼生長增加[5]

小結
綜上所述，我們對四種AAV的組織特異性調控策略進行了如下總結：
 

表3. 四種策略綜合比較

在實際研究中，大家可根據實際實驗需求選擇合適的特異性策略，也可聯合多種特異性調控策略，多管齊下。例如，同時采用原位注射+特定血清型+特異性啟動子。三重保證體內基因的特異性調控。

參考文獻：
[1]高凱, 王軍志. 不同血清型腺相關病毒載體組織表達差異的研究進展[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2007, 14(004):388-392.

[2]Zincarelli, Carmela et al. “Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.” Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16,6 (2008): 1073-80. doi:10.1038/mt.2008.76

[3]Tan, Fangzhi et al. “AAV-ie enables safe and efficient gene transfer to inner ear cells.” Nature communications. 10,1 3733. 19 Aug. 2019, doi:10.1038/s41467-019-11687-8

[4]Bilal, Alina S et al. “Optimizing Adeno-Associated Virus Serotype 9 for Studies of
Cardiac Chamber-Specific Gene Regulation.”
Circulation. 143,20(2021):2025-2027. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.120.052437

[5]Sun, Ji Su et al. “Ventromedial hypothalamic primary cilia control energy and skeletal homeostasis.”The Journal of clinical investigation.131,1(2021):e138107. doi:10.1172/JCI138107

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