血球計數板
 

你知道嗎？血球計數板自18世紀首次被應用于分析人的血液樣本以來，逐漸發展為實驗室細胞計數的標準工具。因為其操作簡單，對實驗環境要求不高，只要有一臺顯微鏡即可進行細胞計數操作。但如果想使用它得出較為精準的結果則對操作者的要求很高，因為在操作時可能會帶來各種誤差：

1、計數操作引入誤差
血球計數板使用步驟較為復雜，計數結果的準確度不僅和上樣后鋪滿計數池的均勻程度相關，同時濃度較高時的鏡下計數難度較大，不同操作者之間的計數差異甚至高達52%，即使同一個人的操作差異仍有可能達20%^[1]。所以需要在實際計數過程中，同一操作者在相同的條件下進行多次計數以減小誤差^[2]。

2、計算過程引入誤差
通過血球計數板獲取的數據結果，需要在鏡下一邊計數一邊記錄，再對結果通過一系列的計算，從而轉化成實際的細胞濃度數據，然后計入細胞原液的稀釋倍數（如臺盼藍的稀釋等），即可得到目的細胞樣品的濃度。計算過程中的誤差也會影響到最終的實驗結果^[3]。

3、樣品制備引入誤差
首先，均勻細胞懸液樣本的準備對計數結果的準確性至關重要。對于某些極易聚團或未能均勻打散的細胞懸液，人工計數時，往往不易識別導致誤差被放大。其次，依據大多數實驗室的習慣，通常會采取對四個頂角的大格內的細胞進行統計計數，每個大格的細胞量一般在30-50個之間時，計數結果會更加準確。這就意味著，細胞懸液濃度過高或過低都不利于獲得準確的結果。多數情況下，我們需要對懸液進行有效的稀釋。

另外，不僅操作因素會導致誤差出現，本身血球計數板的設計對標準化的操作流程也有一定考究。

據一項研究表明，在計數過程中，蓋玻片的位置偏移可造成7.6%的計數差異^[4]，不同品牌的蓋玻片質量厚度對樣品的均勻擴散也會有一定影響。同時血球計數板計數的視野面積也影響著計數的準確度，常用計數板進行普通細胞系計數時的計數面積為1mm2，取樣面積越小，CV值越高、誤差越大^[5]。并且，若血球計數板清潔過度、清洗不到位或操作不當導致計數室存在劃痕會對操作和結果都造成很大影響，被清洗掉的細胞樣本若不妥善處理也會將操作者暴露在生物安全危險下。

計數板的計數面積

很多研究者已經逐漸使用機器的自動計數來代替手動計數，相對來講各方面因素更好控制，得出的結果可靠性更高，目前細胞計數的金標準仍為最為可靠的流式細胞術檢測，但是其高昂的儀器價格和維護成本導致其普及程度和覆蓋情況還不是很廣，所以自動細胞計數儀是目前性價比更高的解決方案。為什么自動細胞計數儀是自動計數最佳方案？

首先，機器計數可減少人工計數過程中造成的誤差，通過軟件算法直接獲得數據結果，其中圖像式的計數儀還能生成清晰的樣本圖像進行保存，方便后續數據處理。

第二，機器自動計數后會根據相應的公式運算規則直接得出結果，并且還會內置輔助計算軟件，將人為計算造成的誤差降到最小。

第三，相對來說機器計數對樣品制備的要求沒那么高，由于技術和算法的區別，比手動計數能識別的濃度準確區間更大，樣本的預稀釋操作在一定程度上被簡化，同時對難離散的細胞懸液中的聚團細胞進行分別識別并獨立計數，提高對分布不均勻樣品計數的準確度。
 

圖像式計數儀采集面積3.5mm2 VS 手動計數1mm2

并且，機器計數一般使用相應的一次性耗材，不僅不需要蓋玻片等額外的耗材，減少上樣操作造成的樣品擴散不均，繼而影響計數結果，同時一次性耗材無需清洗，保證重復性也避免了生物安全危害。另外圖像式的計數儀的采樣面積一般是人工計數的幾倍，采樣面積更大計入細胞更多、更準確。還有很多計數儀有熒光功能，不僅能完成正常的計數操作，還可對不同的熒光標記物進行識別統計。

瑞沃德自動細胞計數儀可對懸液中的細胞快速進行精準定量分析，并同時顯示明場及熒光圖像，清晰呈現計數結果及細胞形態。計數面積更大，應用方位更廣。適用于免疫學及疫苗開發、細胞治療、腫瘤研究、干細胞及代謝研究等研究領域的細胞分析。
 

[1] Freund M, Carol B. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm Concentration in Human Semen. Journal of Reproductive Fertility 1964; 8: 149-55.

[2] Davis JD. THE HEMOCYTOMETER AND ITS IMPACT ON PROGRESSIVE-ERA MEDICINE. Urbana: University of Illinois at Urbana-Champaign; 1995.

[3] Christensen P, Stryhn H, Hansen C. Discrepancies in the Determination of Sperm Concentration using Bürker-Türk, Thoma and Makler Counting Chambers. Theriogenology 2005; 63: 992-1003.

[4] Sanders C, Skerry DW. The Distribution of Blood Cells on Haemacytometer Counting Chambers with Special Reference to the Amended British Standards Specification 748 (1958). Journal of Clinical Pathology 1961; 14: 298-304.

[5]Ramsey JM. The Effects of Size of Sampling Area and Dilution on Leucocyte Counts in a Hemocytometer. The Ohio Journal of Science 1969; 69(2): 101-4.