前言
Western Blot 蛋白質免疫印跡法（簡稱：WB），是基于蛋白質SDS-PAGE電泳分離和特異性抗體識別蛋白的特性，通過顯色達到檢測目標蛋白的一種技術。Western blot 近年來發展迅速，成為了蛋白研究方向的一種主要技術，但由于其實驗步驟和關鍵點多，耗時長，每個步驟可能都會影響最終結果，所以實驗中也會遇到各種問題，導致最終的結果“五花八門”，也讓眾多“新手”抓狂！

關于WB實驗的常見問題，有過不少網絡文獻做過總結和分析，本文將結合前人的經驗對常見的問題進行歸納，給出解決方法，建議收藏！

Western Blot 實驗流程
首先讓我們溫故而知新，回顧一下WB的實驗流程（如圖一所示）
Western Blot免疫印跡雜交試驗步驟多，包含多個影響實驗結果因素，如 SDS-PAGE 膠濃度、轉膜緩沖液、封閉液、一抗抗體及其特異性，二抗孵育及漂洗等。

常見問題
本文將現象總結歸納為以下五類，分析問題的原因，并為大家提供可參考的解決方法。
1. 膜上無信號或無目標條帶  

問題	可能的原因	建議
操作問題	洗膜過度	洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，減少洗膜次數，洗膜時間和溫度
	蛋白未轉到膜上	轉膜結束后，用總蛋白染色劑染膠來確定轉膜效率；轉膜過程中膠與膜完全接觸；轉印夾層排布正確；按照膜的制造商的使用說明潤濕膜；轉印部件在電印跡過程中未過熱；使用正對照和/或分子量 Marker；可以用麗春紅染膜并結合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉至膜上或轉移過頭；適當調整轉膜的時間和電流優化轉印時間和電流。
	蛋白未完全結合到膜上	低分子量的抗原可能會穿過轉印膜，需使用小孔徑的膜進行。
	過度封閉	減少封閉時間，試用不同的封閉液
	底物孵育時間太短	延長底物孵育的時間。
抗體問題	一抗、二抗不匹配	選擇與一抗相匹配的二抗類型，二抗需和一抗宿主的物種相同。可通過設置內參可以驗證二級檢測系統的有效性。
	一抗失效	使用有效期內的抗體，分裝保存，避免反復凍融取用，工作液現用現配。
	結合目標蛋白的抗體不足	降低一抗稀釋度;使用效價高的一抗；延長抗體孵育時間;膜充分浸潤在液體中。
	一抗或/二抗濃度低	增加抗體濃度；
	一抗或/二抗濃度太高	使用太多一抗或二抗可能導致底物迅速耗竭，呈現出很弱的信號
抗原問題	一抗不識別目標蛋白	參照數據庫對比抗原序列和蛋白序列，選擇合適的一抗
	抗原不足或降解	每條泳道上樣量不低于 20~30 ug, 使用蛋白酶抑制劑并設置陽性對照。
		封閉底物可能含有蛋白水解酶活性（如明膠）
緩沖液問題	封閉液與一抗或二抗有交叉反應	更換適合的封閉液
	緩沖液中含有疊氮鈉	疊氮鈉是一種 HRP 的抑制劑，緩沖液不能使用疊氮鈉作為防腐劑。
	ECL發光液失活或靈敏度不夠	更換發光液，選擇超敏發光液
	曝光時間不足	延長曝光時間

2. 目標條帶信號弱 WB結果中可能出現有目標蛋白條帶，但是目標條帶在膜上顏色較淺，原因和解決建議如下：

問題	可能的原因	建議
操作問題	轉膜不充分	規范轉膜的操作；優化電轉條件；可將兩張膜疊加在一起，防止轉膜過度，或使用小孔徑膜
	洗膜過度	洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，減少洗膜次數，洗膜時間和溫度
	封閉過度	減少封閉時間，試用不同的封閉液
	曝光時間過短	延長曝光時間，如使用化學發光成像系統，可調整顯示灰度值
	抗體染色不充分	延長孵育時間或增加抗體濃度
抗體問題	抗體濃度低	增加抗體濃度
	抗體和抗原親和力不足	增加抗體濃度
	抗體活性不足	使用有效期內的抗體，分裝保存，避免反復凍融取用，工作液現用現配。
抗原問題	抗原量不足	增加上樣量
緩沖液問題	緩沖液中含有疊氮鈉	疊氮鈉是一種 HRP 的抑制劑，緩沖液不能使用疊氮鈉作為防腐劑。

3. 圖像高背景
3.1 均一性的高背景

問題	可能原因	建議
操作問題	封閉溫度過高，封閉不完全	封閉液的選擇與優化；使用5%脫脂奶粉封閉；優化封閉時間和溫度
	膜的問題	防止膜過程中干燥；換用NC膜進行實驗；使用干凈鑷子并戴手套操作
	孵育中洗膜不充分	適當增加洗膜時間和次數；確保在充分震蕩的條件下孵育膜，并且抗體充分覆蓋膜表面
	曝光過度	縮短曝光時間，或等待數分鐘后使用成像儀拍攝
抗體問題	一抗，二抗濃度較高	提高一抗，二抗稀釋度，優化稀釋條件
	一抗，二抗和封閉液結合	更換封閉液；更換二抗或降低二抗濃度
	儲存時間較長或儲存條件不當導致抗體失活	選擇新的抗體
抗原問題	緩沖液中去污劑不夠	增加TBST中Tween 20的濃度
緩沖液問題	轉膜液，封閉液等不新鮮或被污染	現用現配

3.2 非均一性高背景

問題	可能的原因	建議
操作相關	封閉溫度過高，封閉不完全	封閉液的選擇與優化；增加封閉液中蛋白濃度；優化封閉時間和溫度
	膜沒有正確潤濕，也可能干過	使用干凈鑷子并戴手套操作；使用足夠液體，膜始終保持濕潤；孵育時使用脫色搖床；避免膜重疊，相互覆蓋
抗體問題	抗體濃度太高	提高一抗，二抗稀釋度，優化稀釋條件
	二抗聚集	使用前過濾二抗或者更換二抗
	封閉劑中有聚集體	使用前過濾封閉劑或者更換
	一抗，二抗和封閉液結合	更換封閉液, 或更換二抗或降低二抗濃度
緩沖液問題	儀器或用具被污染	保證儀器和用具干凈；確保膜上無殘留膠
	轉膜液，封閉液等不新鮮或被污染	使用干凈、新鮮的轉膜液，封閉液。建議現用現配

4. 非特異性條帶多

可能原因	建議
抗體與蛋白非特異性結合	更換抗體
抗體濃度太高	降低上樣量；提高一抗稀釋度。
抗體未純化	使用單克隆或親和層析純化后的抗體，減少非特異條帶
轉膜強度太強，導致雜帶太強	降低轉膜強度（時間和電流），使目標蛋白上方的蛋白少轉移到膜上。
封閉不完全	增加封閉液中蛋白濃度
細胞傳代次數過多，導致其蛋白表達模式分化	使用原代或者傳代少的細胞株，和現在的細胞株一起做參照
新蛋白或同族蛋白分享同種表位的不同剪接方式	查其文獻報導，使用說明書報導的細胞株或組織

5. 條帶形狀異常
5.1 啞鈴狀條帶 該現象可能有兩個原因導致。一是由于配置膠有問題，膠凝固后不均一，可通過重新配置膠，確保膠質量無問題。二是樣品可能含有過多雜質，我們在樣品使用前對其進行離心，以去除過多雜質。

5.2 條帶發白 該現象可能原因是一抗濃度過高，二抗上HRP催化活力太強，同時顯色底物處于臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白。可降低一抗和二抗濃度，或者更換底物。

5.3 條帶拖尾 該現象主要原因是蛋白量太大，或一抗濃度和時間太長，可根據情況調整蛋白量，同時一抗濃度和時間也可以縮短。

5.4 條帶相連 出現該現象的原因可能是上樣量太大或是制膠問題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔。可通過減少上樣量和提高配膠質量來避免該問題。

5.5 條帶呈現微笑狀 電泳條帶或整體出現 “︶ ”形狀，可能原因主要為：電泳速度過快，可通過減少電壓等減慢電泳速度；或是電泳溫度過高，使得膠變形，可在冷室或者冰浴中進行電泳或者改變電泳pH。

5.6 條帶中出現邊緣規則的白圈 該現象很大可能是電轉中膜和膠之間存在氣泡，建議在轉膜前去掉膜和膠之間的氣泡。

總結一下

Western blot 技術目前是蛋白研究中最常用的方法之一，但也因為其步驟繁雜讓結果變幻莫測。但只要規范實驗流程，選用適合的試劑耗材和穩定的成像系統，相信大家都會做出“美麗”的條帶。

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