在篩選的共培養條件下雙向預誘導提高 hUCMSCs 成骨能力的新方法
為了實現骨缺損的非侵入性和更安全的定制化康復，間充質干細胞（MSCs）被建議用于基于3D打印（3DP）制成的骨支架定制的生物活性組織工程骨移植物，從而為臨床環境提供有希望的證據。然而，人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）的獲取數量不能滿足具有侵襲性過程的骨修復的巨大需求，并且細胞活性受供體年齡和健康狀況的影響很大，極大地限制了臨床應用。相比之下，人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs），存在于臍帶華通氏膠（Wharton’s jelly）和血管周圍組織中的一種間充質干細胞，具有更高的細胞產量、快速的增殖能力、大量分泌與細胞遷移、炎癥、免疫調節、血管生成相關的細胞因子。最重要的是，hUCMSCs 不表達負責同種免疫反應的主要組織相容性復合物II（MHC II）和免疫調節因子 B7 共刺激分子。因此，認為 hUCMSCs 在組織工程骨制備過程中同時具有種子細胞和細胞因子的特性，將是增強組織工程骨移植物生物活性的一種有希望的選擇。大量研究還表明，hUCMSCs 具有優異的成骨特性，是適合骨組織工程的種子細胞。鑒于一些研究認為 hUCMSCs 的成骨能力弱于 hBMSCs，因此提高 hUCMSCs 的成骨能力是值得的。
目前有研究已經提出了骨原細胞（干細胞、成骨細胞等）和血管生成細胞（內皮祖細胞、內皮細胞等）的共培養系統，已被證實具有促進成骨和血管生成的協同作用，有利于支架中成骨細胞的存活和預后，從而確保組織工程骨的成功骨化。然而，內皮祖細胞和內皮細胞的體外培養困難，分離的細胞數量非常少，增殖能力有限。此外，在共培養這兩種細胞的臨床應用中，不同的細胞來源會增加免疫排斥和疾病傳播的風險。因此，為降低上述風險，應使用一種來源豐富的單一 MSCs 分別分化為成骨細胞和內皮細胞，然后再進行共培養。迄今為止，關于單一類型干細胞的雙向分化的研究很少。
研究表明，兩種細胞的混合比例以及用于共培養的培養基直接影響成骨的結果。大多數研究人員更喜歡采用兩種細胞按1:1混合的方法，在成骨誘導培養基或共培養培養基（50% 成骨誘導培養基和 50% 內皮生長培養基）中培養。迄今為止，還沒有關于 hUCMSCs 雙向分化的培養條件的詳細報道。
廣州醫科大學附屬口腔醫院、云南省第一人民醫院口腔科、荷蘭阿姆斯特丹牙科學術中心等聯合團隊的一項研究將 hUCMSCs 預誘導分化為成骨細胞和內皮細胞，然后在篩選的培養基中以不同比例共培養。通過比較不同比例的誘導細胞在 3D 打印磷酸三鈣（TCP）支架上制備的組織工程骨移植物與顱骨臨界骨缺損的修復效果，探討并分析了預誘導 hUCMSCs 雙向分化的共培養細胞的成骨效果，為 hUCMSCs 在骨組織工程中的應用提供了一種先進的方法。
目前有研究已經提出了骨原細胞（干細胞、成骨細胞等）和血管生成細胞（內皮祖細胞、內皮細胞等）的共培養系統，已被證實具有促進成骨和血管生成的協同作用，有利于支架中成骨細胞的存活和預后，從而確保組織工程骨的成功骨化。然而，內皮祖細胞和內皮細胞的體外培養困難，分離的細胞數量非常少，增殖能力有限。此外，在共培養這兩種細胞的臨床應用中，不同的細胞來源會增加免疫排斥和疾病傳播的風險。因此，為降低上述風險，應使用一種來源豐富的單一 MSCs 分別分化為成骨細胞和內皮細胞，然后再進行共培養。迄今為止，關于單一類型干細胞的雙向分化的研究很少。
研究表明，兩種細胞的混合比例以及用于共培養的培養基直接影響成骨的結果。大多數研究人員更喜歡采用兩種細胞按1:1混合的方法，在成骨誘導培養基或共培養培養基（50% 成骨誘導培養基和 50% 內皮生長培養基）中培養。迄今為止，還沒有關于 hUCMSCs 雙向分化的培養條件的詳細報道。
廣州醫科大學附屬口腔醫院、云南省第一人民醫院口腔科、荷蘭阿姆斯特丹牙科學術中心等聯合團隊的一項研究將 hUCMSCs 預誘導分化為成骨細胞和內皮細胞，然后在篩選的培養基中以不同比例共培養。通過比較不同比例的誘導細胞在 3D 打印磷酸三鈣（TCP）支架上制備的組織工程骨移植物與顱骨臨界骨缺損的修復效果，探討并分析了預誘導 hUCMSCs 雙向分化的共培養細胞的成骨效果，為 hUCMSCs 在骨組織工程中的應用提供了一種先進的方法。
hUCMSCs 的成骨分化
為了評估 hUCMSCs 的成骨分化能力，進行了 ALP 活性定量和定性分析、成骨相關基因的表達和礦化結節的研究。成骨誘導4、7、10天后，成骨培養基（OM）中 hUCMSCs 的 ALP 染色呈紫色，比增殖培養基（PM）中的顏色更深，第 4 天觀察到的顏色最深（圖1 A），這與 ALP 活性定量檢測一致（圖1 B），表明觀察期內 OM 中 ALP 活性明顯高于 PM，并在第 4 天達到最高水平，分別是第 7 天和第 10 天的兩倍和三倍。同時，成骨誘導后各檢測時間點 ALP 和 OPN 的 mRNA 表達均顯著升高，并隨時間逐漸升高，而 RUNX2 和 COL1 基因的表達僅在第 4 天顯著升高（圖1 C ）。ARS 誘導后第 3 周出現散在性鈣結節，5 周后出現斑塊。PM 組未發現鈣結節（圖1 D）。
圖1 hUCMSCs 的成骨分化。
（A）非誘導和成骨誘導的 hUCMSCs 的 ALP 染色 4、7 和 10 天和（B）ALP 定量分析。
（C）成骨相關基因 ALP、RUNX2、COL1、OPN 在誘導 4、7、10 d后的表達。
（D）非誘導和成骨誘導的 hUCMSCs 的 ARS 持續3 周和 5 周。第 5 周在 OM 中觀察到更多的紅色沉積物。
hUCMSCs 的內皮分化
內皮細胞誘導培養基（EIM）誘導三天后，hUCMSCs 變得細長，呈多邊形，具有大量血管樣結構。由于基質膠上的管形成和 ac-LDL 吞噬作用是確定誘導的 MSCs 是否具有內皮細胞功能的兩個代表性實驗，因此通過這兩個測試檢查了形態和功能的變化。研究表明，4 天的預誘導 hUCMSCs 在基質膠上接種 2.5 小時后，可以形成類似血管的網狀結構，而正常的 hUCMSCs 呈簇狀分布。同樣，預誘導的 hUCMSCs 可以吞噬 Dil-ac-LDL，在藍色細胞核周圍發現紅色熒光標記的 ac-LDL，而非誘導的 MSCs 不具有相同的功能。免疫熒光染色顯示細胞誘導后呈圓形連接，在細胞質中表達動脈內皮細胞標記物 EphrinB2 和靜脈內皮細胞標記物 EphB4。QRT-PCR 檢測發現，誘導后第 4、7、10 天血管生成基因 EFNB2、EPHB4、VEGF、bFGF 表達增強，第 4 天 EFNB2、VEGF、bFGF 表達增強。所有測試的基因表達在第 7 天和第 10 天顯著下降。相比之下，除了抗血管生成基因 SPROUTY1 的表達顯著下降外，SERPINF1 和 ANGPTL1 的表達在整個期間增加，與 EFNB2、VEGF 和 bFGF 的表達相反。
共培養培養基的篩選
當預誘導的 os-hUCMSCs 和 en-hUCMSCs 共培養 17 天時，ARS 顯示在 PM 中以 3:1、2:2 和 1:3 的比例共培養的細胞也具有成骨分化能力，并可形成鈣結節，與陽性對照組無統計學差異。同樣，PM、OM、EMM（合成基礎培養基，OM/EIM）（2:2）組與對照組之間無顯著差異。僅在 PMM（比例混合培養基，OM/EIM）（3:1）培養基中，3:1 組形成大量散在性鈣結節，與其他組相比明顯增加，光密度（OD）值比對照組高 5 倍左右。因此，選擇 PMM（3:1）作為后續的共培養基。
共培養對 hUCMSCs 成骨和血管生成的影響
共培養后，3:1 組的細胞增殖率和 ALP 活性與 OM 中的 4:0 相似，為陽性對照，而 3:1 組成骨相關基因 RUNX2、ALP 的蛋白表達高于 4:0 組。2:2 和 1:3 組的增殖率在整體觀察中維持在較高的標準。從成骨相關基因和蛋白表達來看，2:2 組的 ALP、RUNX2 及其蛋白表達最高。相比之下，1:3 組在第 1 天和第 2 天的 ALP 活性與其他組相比最高, 共培養 3 天后 ALP 基因表達下降, RUNX2 基因及其蛋白表達仍高于 4:0 組。
血管生成分析，與 0:4 組相比，3:1 組 ANG mRNA 表達量在第 3 天最高，2:2 組 PDGFB mRNA 表達量最高，1:3 組 VEGF mRNA 表達量最高。周細胞標志物 CD146 與血管穩定性有關，其基因和蛋白表達從 3:1 組逐漸下降到 0:4 組。
為了進一步說明共培養系統的血管生成能力，采用了基質膠管形成試驗。預誘導3天（0天）后，en-hUCMSCs 混合百分比越高，基質膠上形成的血管小管越多，呈更完整、更連續的圓形。但共培養 3 天后，0:4 組仍具有良好的血管生成能力，但其他組的管狀結構明顯減弱，只有少量的分支結構。
骨缺損的修復
手術后，所有大鼠均恢復良好。顯微CT顯示，術后4周，空白組缺損周邊區域的宿主骨僅長出少量新骨。通過支架植入，支架上形成的骨骼更少。當加入 os-hUCMSCs 時，許多新骨沿支架均勻生長。此外，os-hUCMSCs 與 en-hUCMSCs 的 3:1 比例可以顯著提高骨量、骨小梁數量和厚度。
為了進一步確保骨形成結果，HE 和 Masson 三色染色均被應用。從缺損區域新再生組織的大體上看，沿著宿主骨再生的少量粉紅色結締組織填充有輕微的新骨。通過支架植入，觀察到中央部分有類骨質，有少量毛細血管。通過 os-hUCMSCs 涂層支架植入，紅色染色的成熟骨在中心區域再生，沿著脫鈣 TCP 支架的多孔結構形成致密、規則的結締組織。在 3:1 組中，大量成熟骨散布在深粉色的骨腔，周圍結締組織較少。經 Masson 三色染色，3:1 組可見深紅色染色的成熟骨和淺藍色染色的膠原蛋白，而 4:0 組形成的成熟骨較少。組織學的定量研究也驗證了 3:1 組具有更大的骨誘導能力。
該研究證實，hUCMSCs 具有稍弱的成骨分化能力，可以在短時間內誘導分化成具有內皮功能的內皮樣細胞。雙向分化的 hUCMSCs 在 PM 中共培養成骨細胞和內皮細胞，成骨能力顯著增強。此外，在相同比例的混合培養基中培養時，3:1 組在體外和體內均顯示出最佳的成骨能力。這種雙向預誘導 hUCMSCs 的共培養策略為構建具有生物活性的組織工程骨移植提供了一種新的方法，可用于臨床移植增強成骨能力。
參考文獻：Rong Q, Li S, Zhou Y, Geng Y, Liu S, Wu W, Forouzanfar T, Wu G, Zhang Z, Zhou M. A novel method to improve the osteogenesis capacity of hUCMSCs with dual-directional pre-induction under screened co-culture conditions. Cell Prolif. 2020 Feb;53(2):e12740. doi: 10.1111/cpr.12740. Epub 2019 Dec 9. PMID: 31820506; PMCID: PMC7078770.
圖片來源：圖片來源于參考文獻
文章來源：【http://www.naturethink.com/?news/223.html】
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（C）成骨相關基因 ALP、RUNX2、COL1、OPN 在誘導 4、7、10 d后的表達。
（D）非誘導和成骨誘導的 hUCMSCs 的 ARS 持續3 周和 5 周。第 5 周在 OM 中觀察到更多的紅色沉積物。
hUCMSCs 的內皮分化
內皮細胞誘導培養基（EIM）誘導三天后，hUCMSCs 變得細長，呈多邊形，具有大量血管樣結構。由于基質膠上的管形成和 ac-LDL 吞噬作用是確定誘導的 MSCs 是否具有內皮細胞功能的兩個代表性實驗，因此通過這兩個測試檢查了形態和功能的變化。研究表明，4 天的預誘導 hUCMSCs 在基質膠上接種 2.5 小時后，可以形成類似血管的網狀結構，而正常的 hUCMSCs 呈簇狀分布。同樣，預誘導的 hUCMSCs 可以吞噬 Dil-ac-LDL，在藍色細胞核周圍發現紅色熒光標記的 ac-LDL，而非誘導的 MSCs 不具有相同的功能。免疫熒光染色顯示細胞誘導后呈圓形連接，在細胞質中表達動脈內皮細胞標記物 EphrinB2 和靜脈內皮細胞標記物 EphB4。QRT-PCR 檢測發現，誘導后第 4、7、10 天血管生成基因 EFNB2、EPHB4、VEGF、bFGF 表達增強，第 4 天 EFNB2、VEGF、bFGF 表達增強。所有測試的基因表達在第 7 天和第 10 天顯著下降。相比之下，除了抗血管生成基因 SPROUTY1 的表達顯著下降外，SERPINF1 和 ANGPTL1 的表達在整個期間增加，與 EFNB2、VEGF 和 bFGF 的表達相反。
共培養培養基的篩選
當預誘導的 os-hUCMSCs 和 en-hUCMSCs 共培養 17 天時，ARS 顯示在 PM 中以 3:1、2:2 和 1:3 的比例共培養的細胞也具有成骨分化能力，并可形成鈣結節，與陽性對照組無統計學差異。同樣，PM、OM、EMM（合成基礎培養基，OM/EIM）（2:2）組與對照組之間無顯著差異。僅在 PMM（比例混合培養基，OM/EIM）（3:1）培養基中，3:1 組形成大量散在性鈣結節，與其他組相比明顯增加，光密度（OD）值比對照組高 5 倍左右。因此，選擇 PMM（3:1）作為后續的共培養基。
共培養對 hUCMSCs 成骨和血管生成的影響
共培養后，3:1 組的細胞增殖率和 ALP 活性與 OM 中的 4:0 相似，為陽性對照，而 3:1 組成骨相關基因 RUNX2、ALP 的蛋白表達高于 4:0 組。2:2 和 1:3 組的增殖率在整體觀察中維持在較高的標準。從成骨相關基因和蛋白表達來看，2:2 組的 ALP、RUNX2 及其蛋白表達最高。相比之下，1:3 組在第 1 天和第 2 天的 ALP 活性與其他組相比最高, 共培養 3 天后 ALP 基因表達下降, RUNX2 基因及其蛋白表達仍高于 4:0 組。
血管生成分析，與 0:4 組相比，3:1 組 ANG mRNA 表達量在第 3 天最高，2:2 組 PDGFB mRNA 表達量最高，1:3 組 VEGF mRNA 表達量最高。周細胞標志物 CD146 與血管穩定性有關，其基因和蛋白表達從 3:1 組逐漸下降到 0:4 組。
為了進一步說明共培養系統的血管生成能力，采用了基質膠管形成試驗。預誘導3天（0天）后，en-hUCMSCs 混合百分比越高，基質膠上形成的血管小管越多，呈更完整、更連續的圓形。但共培養 3 天后，0:4 組仍具有良好的血管生成能力，但其他組的管狀結構明顯減弱，只有少量的分支結構。
骨缺損的修復
手術后，所有大鼠均恢復良好。顯微CT顯示，術后4周，空白組缺損周邊區域的宿主骨僅長出少量新骨。通過支架植入，支架上形成的骨骼更少。當加入 os-hUCMSCs 時，許多新骨沿支架均勻生長。此外，os-hUCMSCs 與 en-hUCMSCs 的 3:1 比例可以顯著提高骨量、骨小梁數量和厚度。
為了進一步確保骨形成結果，HE 和 Masson 三色染色均被應用。從缺損區域新再生組織的大體上看，沿著宿主骨再生的少量粉紅色結締組織填充有輕微的新骨。通過支架植入，觀察到中央部分有類骨質，有少量毛細血管。通過 os-hUCMSCs 涂層支架植入，紅色染色的成熟骨在中心區域再生，沿著脫鈣 TCP 支架的多孔結構形成致密、規則的結締組織。在 3:1 組中，大量成熟骨散布在深粉色的骨腔，周圍結締組織較少。經 Masson 三色染色，3:1 組可見深紅色染色的成熟骨和淺藍色染色的膠原蛋白，而 4:0 組形成的成熟骨較少。組織學的定量研究也驗證了 3:1 組具有更大的骨誘導能力。
該研究證實，hUCMSCs 具有稍弱的成骨分化能力，可以在短時間內誘導分化成具有內皮功能的內皮樣細胞。雙向分化的 hUCMSCs 在 PM 中共培養成骨細胞和內皮細胞，成骨能力顯著增強。此外，在相同比例的混合培養基中培養時，3:1 組在體外和體內均顯示出最佳的成骨能力。這種雙向預誘導 hUCMSCs 的共培養策略為構建具有生物活性的組織工程骨移植提供了一種新的方法，可用于臨床移植增強成骨能力。
參考文獻：Rong Q, Li S, Zhou Y, Geng Y, Liu S, Wu W, Forouzanfar T, Wu G, Zhang Z, Zhou M. A novel method to improve the osteogenesis capacity of hUCMSCs with dual-directional pre-induction under screened co-culture conditions. Cell Prolif. 2020 Feb;53(2):e12740. doi: 10.1111/cpr.12740. Epub 2019 Dec 9. PMID: 31820506; PMCID: PMC7078770.
圖片來源：圖片來源于參考文獻
文章來源：【http://www.naturethink.com/?news/223.html】
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