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Western blot免疫蛋白印跡法的發(fā)展、應(yīng)用及傳統(tǒng)濕轉(zhuǎn)跟半干轉(zhuǎn)優(yōu)缺點(diǎn)

瀏覽次數(shù):7245 發(fā)布日期:2022-6-20  來(lái)源:中科通儀

WB最初是由Towbin等人于1979年提出,并稱之為免疫印跡法(immunoblotting)[1]
后于1982年由Burnette將免疫蛋白印跡法稱為Western Blotting[2]。
 


使用含8M尿素的18%聚丙酰胺凝膠分離大腸桿菌核糖體總蛋白后分別進(jìn)行考凝膠馬斯亮染色(圖A)與膜上蛋白印跡酰胺黑染色(圖B)
 

 
Western Blot應(yīng)用[3]:

1、檢測(cè)細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá):通過WB 技術(shù)直接檢測(cè)干細(xì)胞分化、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、周期蛋白、DNA損傷修復(fù)、分子診斷標(biāo)志物等關(guān)鍵通路蛋白,可評(píng)估細(xì)胞或機(jī)體所處的生物學(xué)狀態(tài)。
2、對(duì)基因的功能缺失研究:通過敲減或過表達(dá)目的基因后,用WB 技術(shù)檢測(cè)相關(guān)通路蛋白的表達(dá)變化,以確定目的基因激活或抑制目的蛋白的表達(dá)調(diào)控關(guān)系,探究信號(hào)通路。
3、研究目的蛋白所處的細(xì)胞定位:蛋白的分選投遞與發(fā)揮功能是基因調(diào)控的結(jié)果,因此改變了某些基因的活性,或化學(xué)修飾可能會(huì)影響其效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn),改變細(xì)胞核質(zhì)中的分布,引發(fā)不同的生物學(xué)效應(yīng)。
4、藥物處理、代謝類的研究:
      
 
5、蛋白相互作用類研究:通過WB可檢測(cè)Co-IP、RIP、CHIRP等實(shí)驗(yàn)的IP產(chǎn)物,研究目標(biāo)蛋白-蛋白,RNA-蛋白之間的相互作用。
 
Western Blot法實(shí)際上是凝膠電泳技術(shù)、固定化技術(shù)及分子親和技術(shù)三者融為一體的綜合性技術(shù),其核心在于把WB轉(zhuǎn)膜。

WB轉(zhuǎn)膜是將通過電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體上,如PVDF膜。我們常用電泳印跡法進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)移,電泳轉(zhuǎn)移的方式分為濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者雖然名稱不一,但是原理是一樣的,使用三明治結(jié)構(gòu)(即濾紙-膜-凝膠-濾紙的結(jié)構(gòu)),在電場(chǎng)正負(fù)極作用下將帶負(fù)電的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至載體膜上。蛋白呈現(xiàn)負(fù)電的原因是因?yàn)榈鞍椎入婋奝I一般為6,在溶液中PH>PI時(shí)蛋白呈負(fù)電[4]。
 

傳統(tǒng)濕轉(zhuǎn)跟半干轉(zhuǎn),各有優(yōu)缺點(diǎn)。100KD以下蛋白適用半干轉(zhuǎn),且半干轉(zhuǎn)速率快。因?yàn)榘敫赊D(zhuǎn)的電流不會(huì)側(cè)漏,全都在濾紙之間,所以轉(zhuǎn)的效率比較高,速度快,缺點(diǎn)是有效離子濃度衰減快,可能幾分鐘就耗盡了,這個(gè)時(shí)候大蛋白還沒來(lái)得及轉(zhuǎn)上,再加上產(chǎn)熱大,可能燒糊。相反的,濕轉(zhuǎn)則是有效電流少,不全在濾紙之間,會(huì)從緩沖液間側(cè)漏,所以轉(zhuǎn)的效率低下,速度就慢了,但是有效離子濃度高,能夠長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,因此適用于100KD以上的大分子蛋白的轉(zhuǎn)膜。那么能不能既能有效減少電流側(cè)漏的同時(shí),又不斷補(bǔ)充有效離子的方法呢?有,中科通儀就做到了。

中科通儀自主研發(fā)生產(chǎn)的專利產(chǎn)品M-Blot快速轉(zhuǎn)膜儀是濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)的結(jié)合,從根本上解決了傳統(tǒng)濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)的一些問題。
 

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1.Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1979, 76(9):4350-4.
2.Burnette W N . "Western Blotting": Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A[J]. Analytical Biochemistry, 1981, 112(2):195-203.
3.https://www.sohu.com/a/470319795_121124540
4.Fawcett J S . Isoelectric fractionation of proteins on polyacrylamide gels[J]. FEBS letters, 1968, 1(1):81-82.
發(fā)布者:南京中科通儀科技有限公司
聯(lián)系電話:025-68790636
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