普通PCR引物與qPCR引物的對比與選擇詳解
導讀
說起引物，大家都再熟悉不過了。引物，在核苷酸聚合作用的起始時，可以刺激合成另一種大分子，并與反應物以共價鍵形式連接的序列。在核酸化學中，引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結合在核酸鏈上與之互補的區域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，核酸聚合酶可由其3′端開始合成新的核酸鏈。無論是做普通PCR還是熒光定量PCR，設計合適的引物是非常關鍵的一步。
普通PCR和熒光定量PCR的檢測方式具有較大的差別。熒光定量PCR實時監測與DNA結合的熒光染料激發的熒光，普通PCR通過檢測插入DNA中核酸染料的量來測定PCR最終產物量。熒光定量PCR可以通過擴增曲線進行精確定量，普通PCR則是通過電泳的方式進行定性分析。那么在普通PCR和熒光定量PCR的引物設計方面，有什么相同點和不同點呢？今天小編就給大家匯總一下。
相同處：
▶ 序列的查找是一致的。
▶ 序列選取應在基因的保守區段。
▶ 選取合適的擴增片段大小。
▶ 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對。
▶ 避免引物自身形成環狀發卡結構。
▶ Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%。
▶ 引物之間的Tm相差避免超過2℃。
▶ 引物的3’端避免出現3個或3個以上連續相同的堿基。
不同處：
熒光定量PCR 引物
▶ PCR產物長度：要求在300bp以內，一般首選80-150bp之間。
▶ 引物特異性：對引物要求高，盡量減少引物二聚體的產生，熔解曲線要求單一產物。
▶ 擴增效率：熒光定量 PCR的目的是進行定量或者相對定量，擴增效率應在90%—110%之間。
▶ 多對目的基因同時擴增，文獻上查來的引物條件會不同，需要設計盡可能條件一致的引物。
▶ 目的基因含量比較低時，需要設計靈敏度比較高的引物。
普通PCR 引物
▶ 普通PCR的擴增長度，根據實驗的要求不同，一般是從150bp到幾千bp不等。
▶ 相對于熒光定量PCR，普通PCR對二級結構要求較低。
▶ 對擴增效率要求不高。
▶ 可以選用梯度PCR儀，選擇不同退火溫度，對引物退火溫度要求不需要一致。
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