​使用微波增強的多肽固相合成（SPPS）可以快速制備具有良好純度的環狀二硫鍵多肽（Cyclic disulfide-bridged peptides）。肽激素催產素（Oxytocin）1的合成在3小時內完成，純度為69%。BMP受體激活素樣激酶3(BMP receptor activin-like kinase 3，Alk3) 肽激動劑THR-1232的制備在3小時內完成，純度為77%。CHEC-73是一種淀粉樣蛋白生成的神經保護肽抑制劑，可在3小時內制備，純度為80%。最后，在4小時內合成了一種來自錐螺的肽毒素(conotoxin-SI)4，其含有兩個二硫鍵，純度67%。

 

簡介

含有二硫鍵的環狀肽是一類具有廣泛生物學功能的化合物，包括從毒液到不可或缺的激素⁵。二硫鍵有助于穩定肽的二級結構和構象，提高蛋白水解穩定性和靶標親和力⁶。因為其具有廣闊的治療潛力，人們對合成環狀二硫鍵橋肽的興趣穩步增長。

通過使用正交保護的半胱氨酸氨基酸，例如Fmoc-(S)-Cys(Mmt)- OH和Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH，SPPS可以制備具有二硫鍵的肽（圖1）。Cys(Mmt)基團可以使用三氟乙酸(TFA)的稀溶液選擇性脫保護，而Cys(STmp) 基團使用二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑進行正交脫保護。去保護后，可以使用N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)作為溫和氧化劑，選擇性氧化半胱氨酸硫醇基團以形成二硫鍵⁷。將微波能量應用于二硫橋肽的合成可以實現更有效的偶聯，從而節約合成時間和提高純度(CarboMAXTM)⁸。

圖1 左：Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH；

右：Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH

 

材料和方法

試劑

以下含有指定的側鏈保護基團Fmoc氨基酸購自CEM Corporation (Matthews, NC) ：Ala、Arg (Pbf)、Asn (Trt)、Asp (OMpe)、Gln (Trt)、Gly、Ile、Leu、Lys (Boc)、Phe、Pro、Ser (tBu)、Tyr(tBu) 和Val。Rink Amide ProTideTM LL樹 脂 和Cl-MPA ProTideTM LL樹脂也購自CEM Corporation。Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH和Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH購自EMD Millipore(Burlington,MA)。N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)、DL-二硫蘇糖醇(DTT)、4-甲基嗎啉(NMM)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)、哌啶、哌嗪、三氟乙酸(TFA)和三異丙基硅烷(TIS)購自Sigma-Aldrich（St. Louis,MO）。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1-甲基-2- 吡咯烷酮(NMP)、乙醇、無水乙醚(Et2O)、乙酸、HPLC級水和乙腈購自VWR(West Chester,賓夕法尼亞州)。LC-MS 級水(H2O)和LC-MS 級乙腈(MeCN)購自Fisher Scientific(Waltham, MA)。
多肽合成：催產素（Oxytocin）, CYIQNCPLG-NH2

使用CEM Liberty Blue™自動微波肽合成儀在0.526g Rink Amide ProTide LL樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g ）上以0.10mmol規模合成多肽（圖2），以0.05mmol規模進行二硫化物形成。用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure的DMF溶液進行脫保護。偶聯反應在5倍過量的0.2M Fmoc-AA與1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure的DMF中進行(CarboMAX)⁸。Fmoc-(S)- Cys(Mmt)OH用作C端氨基酸。2%TFA的DCM溶液用于去保護Cys(Mmt)基團。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成二硫化物。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS的CEM Razor™高通量肽切割系統進行切割。裂解后，用無水乙醚沉淀肽并凍干過夜。

圖2：催產素

多肽合成: THR-123, CYFDDSSNVLCKKYRS-CO2H

使用CEM Liberty Blue自動微波肽合成儀在0.556g Cl-MPA ProTide LL樹脂（離子交換容量：0.18 meq/g）上以0.10mmol規模合成肽（圖3）（以0.05mmol規模進行二硫化物形成）。用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure的DMF溶液進行脫保護。偶聯反應在5倍過量的0.2M Fmoc-AA 1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure在DMF(CarboMAX)中進行。8Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于半胱氨酸C。A溶液DCM中2%TFA用于去保護Cys(Mmt)。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成二硫化物。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS 的CEM Razor高通量肽切割系統進行切割。裂解后，用無水乙醚沉淀肽并凍干過夜。

圖3：THR-123

多肽合成 ：CHEC-7, CHEAAQC-CO2H

使用CEM Liberty Blue自動微波肽合成儀在0.556g Cl-MPA ProTide LL樹脂（離子交換容量：0.18 meq/g）上以0.10mmol規模合成肽（圖4），以0.05 mmol規模進行二硫化物形成。用10%哌嗪在1:9乙醇/NMP 中的溶液進行脫保護。偶聯反應在5倍過量的0.2M Fmoc-AA與1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure在DMF中進行(CarboMAX)⁸。Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于半胱氨酸C。溶液DCM中2%TFA用于去保護Cys(Mmt)基團。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成二硫化物。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS的CEM Razor高通量肽切割系統進行切割。裂解后，用無水乙醚沉淀肽并凍干過夜。

圖4：CHEC-7

多肽合成：Conotoxin-SI, ICCNPACGPKYSC-NH2

使用CEM Liberty Blue自動微波肽合成儀在0.526g Rink Amide ProTide LL樹脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上以0.10mmol規模合成肽（圖5）（以0.05mmol規模進行二硫化物形成）。用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure的DMF溶液進行脫保護。偶聯反應在5倍過量的0.2M Fmoc-AA與1.0M DIC和1.0M Oxyma Pure的DMF(CarboMAX)⁸中進行。Fmoc-(S)Cys(Mmt)-OH用于C，Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH用于半胱氨酸C。5% DTT和0.1M的NMM的DMF溶液用于去保護Cys(STmp)基團。使用25mM NCS在DMF中的溶液形成第一個二硫化物。2% TFA在DCM中的溶液用于去保護Cys(Mmt)。使用相同的NCS在DMF中的溶液形成第二個二硫鍵。使用具有95:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS的CEM Razor高通量肽切割系統進行切割。裂解后，用無水乙醚沉淀肽并凍干過夜。

圖5：Conotoxin-SI

多肽分析

在配備有PDA檢測器的Waters Acquity UPLC系統上分析肽，該檢測器配備Acquity UPLC BEH C8柱（1.7mm和2.1x100mm）。UPLC系統連接到Waters 3100 Single Quad MS用于結構測定。在Waters MassLynx軟件上進行峰分析。使用0.05% TFA的(i)H₂O和(ii)MeCN溶液梯度洗脫進行分離。

 

結果

Liberty Blue自動微波肽合成儀上使用微波增強SPPS產合成催產素，產生了純度為69%的目標肽（圖6）。

圖6：催產素的UPLC色譜圖

在Liberty Blue自動微波肽合成儀上使用微波增強SPPS合成THR-123，產生了純度為77%的目標肽（圖7）。

圖7：THR-123的UPLC 色譜圖

在Liberty Blue自動微波肽合成儀上使用微波增強SPPS合成CHEC-7，產生了80%純度的目標肽（圖8）。注意：5.72 min（參見圖9）和5.85min（參見圖10）處的峰均具有目標肽質量，不是差向異構化的結果。

圖8：CHEC-7 的UPLC色譜圖

圖9：保留時間為5.72分鐘的峰質譜圖

圖10：保留時間為5.85 分鐘的峰質譜圖

Liberty Blue自動微波肽合成儀上使用微波增強SPPS合成芋螺毒素-SI，產生了純度為67%的目標肽（圖11）。

圖11 ：Conotoxin-SI 的UPLC色譜圖

 

結論

使用自動微波增強多肽固相合成（SPPS）可以快速有效地合成二硫鍵橋接環肽。催產素的常規室溫合成需要超過13小時才能生成二硫鍵橋接肽⁷。使用微波增強SPPS，該肽在3小時內合成，純度為69%。在3小時內以高純度（分別為77%和80%產率）快速合成了具有C末端酸的環狀二硫鍵橋肽THR-123和CHEC-7。含有兩個二硫鍵的芋螺毒素-SI的常規室溫合成需要20小時⁷。另一方面，微波增強的SPPS可在4小時內提供純度為67%的肽。

 

參考文獻

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[3]Cunningham, T. J.; Greenstein, J.; Yao, L.; Fischer, I.;  Connors, T. Rejuvenation Res. 2018, rej.2017.2049. [4]Azam, L.; McIntosh, J. M. Acta Pharmacol. Sin. 2009, 30 (6),  771–783. 

[5]Góngora-Benítez, M.; Tulla-Puche, J.; Albericio, F. Chem. Rev. 2014, 114 (2), 901–926. 

[6]Adessi, C.; Soto, C. Curr. Med. Chem. 2002, 9 (9), 963–978. 

[7]Postma, T. M.; Albericio, F. Org. Lett. 2013, 15 (3), 616–619. 

[8]CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced  Peptide Coupling at Elevated Temperature”. 

[9]CEM Technical Note (P/N: 600837) - “Cl-MPA ProTide and  Cl-TCP(Cl) ProTide Resin Loading and Protected Cleavage  Procedures”.