圖1. nFCM評估EVs藥物裝載策略

圖2. EVs的鑒定和表征

載藥策略對比
由于Dox具有自發熒光特性，與未裝載Dox的EVs相比，裝載了Dox的EVs表現出明顯的橙色熒光信號，陽性顆粒的比例可達46.3%；在共孵育方法中，隨著Dox濃度的增加，陽性EVs的比例持續上升，當Dox濃度為100 μM時，EVs的陽性率達到最高，接近50%（圖3）；

以優化后的Dox濃度(100 μM)為參考，評估對比了共孵育、電穿孔、擠出法、反復凍融、超聲和表面活性劑處理這六種方法對EVs載藥效率、顆粒濃度、藥物裝載量等影響。結果顯示共孵育和電穿孔法具有最高的裝載效率，均為40%以上，而其他幾種藥物裝載策略陽性率在20%-30%之間（圖3）。總的來說，考慮到藥物包封率、顆粒濃度、藥物裝載量等因素，共孵育和電穿孔是這幾種方法中最理想的EVs藥物裝載策略。
 

圖3. 不同藥物裝載策略的載藥效率、藥物裝載量對比

生物功能分析
EVs表面蛋白是其功能形式的重要參與者，對EVs的免疫逃逸和靶向具有重要作用，作者進一步研究了不同藥物裝載策略對EVs表面蛋白的影響。結果發現，共孵育和電穿孔方法處理后EVs的表面蛋白(CD24、CD47、CD63)表達比例相對更高，說明這兩種方法能夠最大限度地保持了EVs的生物活性，而擠出法、反復凍融、超聲和表面活性劑處理都會不同程度地破壞EVs的表面蛋白（圖4）。
 

圖4. 不同載藥策略對EVs表面蛋白的影響

作者進一步評估了不同策略所得載藥EVs中藥物穩定性和活性（圖5）。結果顯示在4℃和-80℃條件下保存，隨著時間的延長，六種裝載策略獲得的EVs陽性率均出現下降，而共孵育方法獲得的EVs在長期保存下還能保持較高的藥物包裹效率（約40%）。綜上，無論何種載藥方式，都建議將裝載Dox的EVs儲存在4℃，且共孵育制備的Dox-EVs顯示出最高的包封率和穩定性。
 

圖5. 載藥后EVs的穩定性研究

藥物作用效果
作者還探究了不同藥物裝載策略所得Dox-EVs的藥物活性和細胞攝取效率。共聚焦顯微鏡和流式細胞術的結果均證實電穿孔的方法獲得的EVs具有更高的細胞攝取效率，同時更容易誘導細胞凋亡（圖6）。該結果與nFCM測定的不同方法藥物包封效率和藥物包裹量相吻合，說明了Dox-EVs的治療效果與細胞攝取率密切相關，并從本質上與Dox的包封率有關，揭示了利用nFCM對EVs進行單顆粒載藥表征的準確性和重要價值。
 

圖6. 不同載藥策略的藥物活性

總結
本研究利用nFCM在單EV水平對六種不同的載藥策略進行了全面的評估。實驗結果表明：

• 共孵育和電穿孔方法可以獲得更高的裝載效率，單個EVs中Dox含量也最高；

• 共孵育和電穿孔方法制備的EVs藥物具有更高水平的細胞攝取和更顯著的促進腫瘤細胞凋亡；

• 共孵育方法獲得的EVs無論在4℃或-80℃長期保存條件下，均具有更好的穩定性；

nFCM作為一個高效的單顆粒表征平臺，可應用于EVs研究的各個環節，包括分離純化、質量控制、EVs載藥方法評估和優化、穩定性監測等方面，加速推進EVs產業化的發展！

參考文獻
Chen, C., Li, Y., Wang, Q. et al. Single-particle assessment of six different drug-loading strategies for incorporating doxorubicin into small extracellular vesicles. Anal Bioanal Chem 415, 1287–1298 (2023). https://doi.org/10.1007/s00216-022-04248-4