磁珠是何方神圣？ 如何慧眼識“珠”？  

生物磁珠一般是具有細小粒徑 (μm) 的超順磁微球。具有以下特點： 

1) 超強順磁性，在磁場中能夠迅速聚集，離開磁場后又能均勻分散；

2) 合適且均一的粒徑，保證其具有足夠強的磁響應性又不會沉降；

3) 豐富的表面活性基團，以便和生物分子偶聯，并在外磁場的作用下實現與被待測樣品的分離。

 

圖 1. MCE 磁珠組成

A、G、L、A/G 代表 Protein A、Protein G、Protein L 及 Protein A/G；

Anti-HA、Anti-Flag、Anti-c-Myc、Anti-GST 代表 Anti-HA 抗體、Anti-Flag 抗體、Anti-c-Myc 抗體及 Anti-GST 抗體

 

選磁珠時，首先關注磁珠磁性 (磁吸時間)、粒徑 (大小及均一度) 等。其次根據實驗目的，選擇合適的表面活性基團以及由此衍生的偶聯方式、蛋白結合量等。

 

比如，如果您的目標蛋白帶有融合標簽，可一步到位選擇：

· Anti-HA Magnetic Beads (HY-K0201)

· Anti-Flag Magnetic Beads (HY-K0207)

· Anti-c-Myc Magnetic Beads (HY-K0206)

· Anti-GST Magnetic Beads (HY-K0222)

 

如果您的目標蛋白帶有生物素標記，可選擇

· Streptavidin Magnetic Beads (HY-K0208)

 

如果您有可識別靶蛋白的抗體，可選擇

· Protein A/G Magnetic Beads (HY-K0202)

· Protein A Magnetic Beads (HY-K0203)

· Protein G Magnetic Beads (HY-K0204)

· Protein L Magnetic Beads (HY-K0205)

 

下面以 Protein A/G 磁珠為例，詳述 IP 實驗步驟、可能存在的問題及解決方法。

 ■ Step 1——抗原樣品制備

制備抗原樣品 (細胞裂解物) 是 IP 的第一步，也是關鍵的一步。正確的細胞裂解液可以穩定天然蛋白質構象、抑制酶活性、最大限度地減少抗體結合位點變性并釋放細胞或組織中的蛋白質。一般可選 NP-40、RIPA、Western 及 IP 細胞裂解液等。抗原樣品應始終保存在冰上，并將蛋白酶抑制劑 添加到裂解液中以防止蛋白水解。

 

注 1：Co-IP 實驗時，常用 NP-40 等非離子型裂解液，以免破壞蛋白-蛋白相互作用。

注 2：確保目的蛋白在抗原樣品中有較高水平表達。

 

■ Step 2——樣本結合

通過此步驟，您將獲得磁珠—抗體—抗原樣品復合物。磁珠、抗體、抗原樣品的加樣順序對靶蛋白得率有一定影響。

 

All in one——直接將磁珠、抗體、抗原樣品混合到一起；

直接結合——抗體和磁珠先結合，再和抗原樣品結合；

間接結合——抗體和抗原樣品先結合，再和磁珠結合。

 可選步驟 1——抗原樣品預處理：為減少非特異性結合，可將抗原樣品單獨與 Protein A/G 磁珠或同型對照抗體結合。(預處理有助于去除在 IP 過程中可能與抗體或磁珠非特異性結合的分子，從而改善信噪比。) 

可選步驟 2——抗體的交聯固定：如果不希望抗體與目標蛋白共洗脫，可在直接結合時，使用交聯劑將抗體共價連接到 Protein A/G 上。后續使用酸性洗脫法洗脫靶蛋白。

(直接將磁珠、抗體、抗原樣品混合到一起，速度最快，但獲得的靶蛋白純度和得率會很低；間接結合靶蛋白得率最高，但在洗脫步驟時，抗體會和靶蛋白一起被洗脫；直接結合，蛋白得率也較高，且可通過交聯固定抗體，達到單獨洗脫靶蛋白的目的。)
一般情況下，如果靶蛋白豐度較高，直接結合與間接結合差別不大，均可選；如果靶蛋白豐度不高，可選間接結合以獲得更高的靶蛋白得率。 樣本結合步驟中的結合/洗滌緩沖液也非常重要。一般情況下，您的結合/洗滌緩沖液可以為同一種緩沖液，如 TBST/PBST。另外可通過加入去垢劑 (如 0.5-1% NP-40/TritonX-100/Tween-20)、增加鹽離子濃度 (如 250 mM NaCl/1-2 mM DTT/β-ME)、增加洗滌次數等來提高洗雜效率。

 

■ Step 3——抗原洗脫

一般根據下游應用選擇洗脫方法：

 

 

1) 變性洗脫法：如果下游分析是用免疫印跡 (Western Blot)，則通常直接使用 SDS-PAGE Loading Buffer 進行洗脫 (95°C 加熱 5 mins)。該緩沖液可使蛋白質變性還原并用于電泳，十分高效，適用于親和作用的解離。但該方法也會洗脫下抗體等非靶分子，且獲得的蛋白不具備生物活性。 
2) 酸性洗脫法：0.1 M-0.15 M 甘氨酸 (pH 2.5-3) 是 IP 中最高效的非變性洗脫緩沖液，低 pH 水平可以解離大多數抗體-抗原相互作用。此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。但酸性洗脫不是好的方法，采用該緩沖液可能無法解離某些抗體—抗原相互作用，而且部分抗體對低 pH 環境敏感。 
注 1：在洗脫前的接收管中提前加入中和液，可緩解抗體對于低 pH 環境的敏感。注 2：低 pH 水平也可以解離未交聯情況下的抗體—Protein A/G 相互作用。如果不希望抗體與靶蛋白共洗脫，可在樣本結合步驟時，使用交聯劑將抗體共價連接到 Protein A/G 上。而后再用酸性洗脫法洗脫靶蛋白。 
3) 競爭性洗脫法：如果靶蛋白帶有標簽，可用高濃度標簽或配體進行競爭性洗脫。如 Flag 標簽蛋白，可用 3×Flag peptide 競爭性洗脫，此方法洗脫的樣品保持原有生物活性，可用于后期功能分析，而且還沒有抗體片段污染。

 

■ Step 4——WB 驗證

設計好實驗，優化好條件，配好各種 buffer 和工作液，按照 protocol，小心翼翼的絲毫不敢怠慢，一通操作猛如虎，一看結果。

 

1) 靶蛋白信號微弱或無信號

靈魂五問：蛋白表達了嗎？上樣量足夠嗎？孵育時間充足嗎？裂解液選的合適嗎？洗脫方法合適嗎？

 

 

解決方案詳戳 “冬風吹，戰鼓擂，蛋白純化，我怕誰！

 

2) 高背景值或多條帶

a. 優化蛋白上樣量，IP 時總蛋白上樣量過多可能會造成非特異性結合，建議上樣量為 1 mg 左右；蛋白電泳時，優化上樣量以觀察特定信號；b. 優化洗滌緩沖液，通過向洗滌緩沖液中加入去垢劑 (如 0.5-1% NP-40/TritonX-100/Tween-20)、增加鹽離子濃度 (如 250 mM NaCl/1-2 mM DTT/β-ME)、增加洗滌時間、洗滌次數等降低背景；c. 非必需的高強度洗脫緩沖液 (如 SDS-PAGE 上樣緩沖液) 將導致多種非特異蛋白 (如Protein A/G 或鏈霉親和素亞基) 與抗原一起被共洗脫下來。溫和的緩沖液 (如 0.1 M 甘氨酸，pH 2.5) 可以防止此類污染；d. 抗體污染問題：參考前面關于抗體交聯固定的討論或使用不同種屬的一抗進行 IP 和蛋白質免疫印跡檢測；e. 使用恰當的蛋白酶抑制劑，防止蛋白降解；

f. 對抗原樣品預處理 (將抗原樣品單獨與 Protein A/G 磁珠或同型對照抗體結合)，可減少部分非特異性結合。

 3）陽性及陰性對照設置

成功的條帶總是相似的，失敗的條帶各有各的不同。分析結果時，有陰性、陽性對照能一步到位幫您分析原因。

 

陽性對照：證實細胞裂解物中確實存在靶蛋白 (IP) 或者互作蛋白對 (Co-IP，比如誘餌蛋白 X 和靶蛋白 Y)，即為常說的 input。可直接使用細胞裂解物或者抽提好的蛋白溶液進行 Western Blot。

 

陰性對照：IP/Co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白對都檢測到了，固然是值得高興的，但是這結果是不是假陽性呢？還得做個陰性對照。例如，同型對照抗體 (沒有特異靶標的一抗，但在類別和亞型上，其跟實驗應用中的靶標一抗一致) 等。

 

Output：在某些 Co-IP 實驗中，實驗人員會把 IP 后的上清分別進行誘餌蛋白 X 和靶蛋白 Y 的 WB 檢測，該對照組稱為 output 組。

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好了，說了這么多，希望本篇對大家有所幫助，祝伙伴們拿到心儀的實驗結果。