腺相關病毒 (Adeno-associated virus，AAV) 因其低免疫原性、低基因毒性、在多種不同組織類型具有持久基因表達、作用時間長以及易于生產等特性，成為了臨床基因治療領域廣泛應用的基因治療載體^[1]。AAV病毒屬于細小病毒家族，無包膜，由衣殼蛋白和單鏈DNA（全長4.7kb）組成。不同血清型的AAV均由三種不同的衣殼病毒蛋白（VP：VP1（～80 kDa），VP2（～65 kDa）和VP3（～60 kDa））按照摩爾比約1:1:10組裝成二十面體結構^[2]。衣殼蛋白除保護病毒基因組外，在介導受體結合、病毒逃逸，將病毒DNA運送至靶標細胞中發揮重要作用。衣殼蛋白序列或者翻譯后修飾的改變，均可影響病毒載體的靶向性和感染性^[3]。
 
因此，確保AAV藥物應用于人基因治療的有效性和安全性，對AAV載體質量屬性進行監控具有重要意義。相較于治療性蛋白，大多數AAV樣本蛋白質濃度低（0.01-0.1mg/mL），可用于分析的樣本量有限，給AAV表征分析帶來巨大挑戰^[4]。微流速液相色譜串聯質譜（Microflow LC/MS-MS）系統以其高通量、穩定的分析性能，兼具良好的靈敏度等特點，被廣泛的應用于蛋白質組學、生物制品表征分析^[5]。
   
本研究中，SCIEX合作中國食品藥品檢定研究院重組室，應用微升流速液相色譜串聯質譜技術（Microflow LC-MS/MS）對低濃度的AAV2衣殼蛋白（8×10¹¹ GC/mL）進行表征分析，發表在期刊《Applied Biochemistry and Biotechnology》上。通過數據依賴型采集（Information dependent acquisition，IDA）技術進行肽圖分析，實現了對AAV2衣殼蛋白將近100%的序列覆蓋度，同時獲得超過30個翻譯后修飾位點鑒定和相對定量信息。通過碰撞誘導解離（CID）技術，獲得高質量二級質譜數據實現氨基酸序列完整匹配，以及應用電子活化解離EAD技術實現氨基酸同分異構體區分。微升流速液相色譜（Microflow LC）系統聯合ZenoTOF^® 7600 系統在實現高通量、穩定分析的同時，兼具良好靈敏度，為大批量、低濃度生物制品樣本表征分析提供技術支撐。
    

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AAV2衣殼蛋白序列覆蓋度分析
 
ZenoTOF^® 7600 系統，Zeno^™ trap，將占空比提高到大于90%，減少離子損失，實現更高的MS/MS靈敏度。結合具有穩定、高通量，同時兼具良好靈敏度的微升流速液相色譜系統對低樣本量的AAV2樣本進行分離，在提升分析靈敏度的同時，獲得高質量的二級譜圖。通過數據庫的匹配分析，AAV2衣殼蛋白序列覆蓋度將近100%（圖1）。其中通過二級質譜數據匹配的序列達95%，通過一級質譜數據匹配的序列為5%。
 
 
 
AAV2衣殼蛋白翻譯后修飾分析
 
Biologics Explorer^™ 軟件通過預建立的分析流程，在數據庫匹配分析模塊設置翻譯后修飾類型，實現翻譯后修飾位點快速、流程化鑒定和定量分析。應用Biologics Explorer^™ 軟件分析，在AAV2衣殼蛋白中共鑒定到32個修飾位點（表1），修飾類型包括脫酰胺、氧化、乙酰化修飾。其中相對豐度 >1%的PTMs有20個。相對豐度 <1%的PTMs有11個，如N317、Q319、Q464的脫酰胺修飾，A2和L315乙酰化修飾。
 
應用高靈敏度的微升流速液相色譜系統和Zeno^™ trap技術，在實現對低豐度翻譯后修飾肽段分析的同時，獲得肽段高質量的二級質譜圖，實現肽段序列完整匹配。圖2分別展示了在第464位和第614位的谷酰氨（Q）發生脫酰胺修飾肽段LQFSQAGASDIR（圖2A）和DVYLQGPIWAK（圖2B）的Native和脫酰胺修飾兩種形式的提取離子色譜圖。兩條肽段脫酰胺修飾形式的相對豐度均很低，其相對豐度分別僅為0.07% (LQFSQAGASDIR) 和0.38% (DVYLQGPIWAK) 。
 
  
  
蛋白質脫酰胺化是天冬酰胺殘基側鏈發生脫酰胺反應形成天冬氨酸（Asp）或異天冬氨酸（isoAsp）。AAV載體的脫酰胺化可影響衣殼蛋白組裝和轉導效率，以及影響其組織趨向性和衣殼蛋白與免疫系統的互作^[6]。碰撞誘導解離（CID）碎裂是常用的質譜碎裂技術，能夠提供氨基酸序列確認。然而，其在區分同分異構體，如Asp和isoAsp具有較大挑戰。而電子活化解離（EAD）技術可產生特征性的診斷碎片離子，實現氨基酸異構體的區分^[7]。肽段YLGPFNGLDK存在三種脫酰胺修飾形式，EAD二級圖譜展示（圖3B、D），通過診斷離子z5-57確定肽段YLGPFNGLDK在保留時間22.3min和24.8min對應為isoAsp形式。診斷離子z5-44確證保留時間23.1min對應為Asp形式（圖3C）。據文獻報道，兩種isoAsp形式，L-isoAsp形式豐度相對更高^[8,9]。
 

圖3. EAD碎裂模式下，肽段YLGPFNGLDK三種脫酰胺修飾形式XIC圖譜（A）及通過EAD碎裂產生的診斷離子確定為Asp或isoAsp（B-D）。通過z5-57診斷離子(綠色標注) 確證為isoAsp (B、D)，通過z-44診斷離子確證為Asp (C) 。
 
 
小結
 
1 微升流速液相色譜系統具有穩定、高通量，兼具良好靈敏度的特性，應用微升流速液相色譜系統聯合ZenoTOF^® 7600 系統實現了對低樣本量AAV2衣殼蛋白將近100%氨基酸序列覆蓋分析。
2 Zeno^™ trap 技術顯著提高二級質譜靈敏度，結合CID采集技術獲得高質量二級質譜數據，實現氨基酸序列高可信度的完整匹配。
3 EAD碎裂技術提供翻譯后修飾位點準確定位，以及區分氨基酸同分異構體，為生物制品深度、精準表征分析提供技術支撐。
4 Biologics Explorer^™ 軟件提供便捷、流程化的分析工具，實現包括完整分子量、肽圖分析、翻譯后修飾位點鑒定及相對定量快速、自動化分析。
 
 
參考文獻
[1] Leszek Lisowski., Szun Szun Tay., & Ian Edward Alexander. Adeno-associated virus serotypes for gene therapeutics. Current Opinion in Pharmacology. 2016. 24, 59–67.
[2] R.J. Samulski, N. Muzyczka. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annual Review of Virology. 2014.1: 427–451.
[3] Jin X, Liu L, Nass S, et al. Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis for Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus Capsid Proteins. Human Gene Therapy Methods. 2017. 28(5):255-267.
[4] Guapo F, Strasser L, S Millán-Martín, et al. Fast and efficient digestion of adeno associated virus (AAV) capsid proteins for liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) based peptide mapping and post translational modification analysis (PTMs). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2022. 207:114427.
[5] Vowinckel J, Zelezniak A, Bruderer R, et al. Cost-effective generation of precise label-free quantitative proteomes in high-throughput by microLC and data-independent acquisition. Scientific Report. 2018, 8(1):4346.
[6] April R, Giles, Joshua J, et al. Deamidation of Amino Acids on the Surface of Adeno-Associated Virus Capsids Leads to Charge Heterogeneity and Altered Vector Function[J]. Molecular therapy.2018. 26(12): 2848–2862.
[7] Differentiation of aspartic and isoaspartic acid using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note RUO-MKT-02-12550-B.
[8] Comparative analysis of intact AAV8 capsid proteins derived from SF9 and HEK293 cell lines. SCIEX technical note RUO-MKT-02-12917-A.
[9] Marine Morvan and Ivan Miksik. Recent advances in chiral analysis of proteins and peptides. Separations. 2021. 8(8): 112.