存在的問題:
完整膜蛋白結晶最佳條件的發現對于研究者而言非常耗時。晶體可能需要兩周或更長時間才能形成,這使得優化結晶生長條件的過程極其漫長。
光漂白后的熒光恢復 (FRAP)
預篩選結晶條件以消除那些不利于結晶的條件。用戶可以在短短 30 分鐘內將這些條件縮小范圍至一小部分利于結晶的條件。
如果蛋白質不能在脂質立方相中擴散,
那么它們就不可能形成晶體。
FRAP 系統可以檢查蛋白質制劑,節省用戶時間
為獲得完整的膜蛋白,FRAP 在廣泛不同的鹽晶條件下對 96 孔板進行檢測。在大多數條件下良好的光漂白熒光恢復意味值得用該樣品進行 LCP 結晶。
FRAP 可以用來確定哪種蛋白質制劑最好
我們使用兩種不同的去污劑對一個完整的膜蛋白進行純化,因此在廣泛的結晶條件下 FRAP 熒光恢復存在顯著差異。這里 LDAO 被證明是一種更適合純化的去污劑,應該用于結晶試驗。如果在 SDS 中純化的蛋白質幾乎沒有遷移率,那么它就不會結晶。
在 30 分鐘內篩選 96 種結晶條件
FRAP 能夠自動分析 96 孔 LCP 板以確定每個液滴的遷移率。每個孔都通過聚焦的激光點進行光漂白,并測量固定時間點后的熒光恢復。而在液滴中可遷移的蛋白質百分比表明是否可能發生結晶。
FRAP 成像儀發射光漂白激光脈沖,該脈沖從二向色鏡反射,通過激發濾光片,再被第二個二向色鏡反射,從而漂白樣品。
LED 通過聚光鏡照射光線,光線沿著與激光相同的路徑,照亮樣品。
接著處理熒光圖像以確定表明蛋白質遷移率的光漂白點的恢復時間。
數據分析容易
系統提供的軟件組用于跟蹤和分析每個實驗的得分。得分以顏色編碼的概覽顯示,讓用戶一眼就能識別出結晶孔。用戶可以在軟件中對結晶孔進行標記,以備日后參考。在上面的例子中,H8 孔蛋白遷移率最高,最有可能生長晶體。D12 孔遷移率為零,最不可能生長晶體。