FIDA技術的應用：通過流動誘導分散分析（FIDA）技術表征構象變化
· 蛋白質 - 小分子相互作表征
· 天然條件和微量樣品檢測
· 同時評估結合親和力，構象變化和絕對大小
介紹
許多生物學過程通過蛋白與小分子或其他蛋白的相互作用進行調節。在許多情況下，這些相互作用會引起構象變化，該變化直接調節活性或提供新的結合位點，以促進建立高階復合物。作為模型系統，本次實驗我們使用了細菌性結合蛋白超家族的麥芽糖結合蛋白（MBP）。
MBP是麥芽糖糊精轉運系統的可溶組分，駐留在革蘭氏陰性細菌的周質中，在該細菌的周質中，它可以將其配體（Maltose，Maltotriose和Maltoheptaose）運送到膜結合的轉運蛋白復合物。MBP的配體結合位點位于兩個球狀結構域之間。
圖1.（a）MBP（42.5 kDa）Apo狀態（左，開放）以及與Maltose（360 Dalton）結合形成的麥芽糖結合態MBP（右，關閉）；（b）MBP的開放式（淺藍色）和封閉式（淺粉紅色）結構的對比。
材料和方法
該實驗采用FIDA Neo儀器，480 nm LED熒光檢測模塊（FIDABIO ApS）。
1. 耗材：FIDA標準毛細管（i.d.：75 µm，LT：100cm，Leff：84 cm）。
2. 緩沖液：Tris緩沖液pH 7.4（20mm Tris，150mmNaCl，0.05％Tween）。
3. 指示劑：MBP（4.3ug/mL，100nM）， MBP用Atto 488 NHS （Sigma Aldrich）標記。
4. 分析物：麥芽糖（O-α-D-Glucopyranosyl-D-glucose），0-1000 µM。
通過用分析物填充毛細管，然后注射指示劑與分析物共孵育混合物，在400 mbar下流經探測器進行樣品分析。
結果
麥芽糖會引起麥芽糖結合蛋白的構象變化。
FIDA技術提供了對流體動力半徑（Rh）的絕對測量，并用于測量與麥芽糖（0.3 kDa）結合后ATTO488標記的MBP（42.5 kDa）的尺寸變化。如圖2A所示，在25°C下繪制了MBP表觀Rh隨麥芽糖濃度（0-1000 µM）變化的函數曲線。MBP的Rh從2.88nm降低至2.62nm，對應于0.26nm的ΔRh，清楚地表明結合后的結構變化（圖2A）。結合數學模型，通過流體動力半徑（Rh）變化的數據解析，該相互作用親和力KD≈10 µM，與文獻[1,2]報道一致。在圖2中，顯示了單獨MBP和MBP-麥芽糖的疊加FIDA信號。在圖2B中，指示劑峰在麥芽糖存在下變窄。利用FIDA 泰勒分散分布圖的峰面積，可同時探測MBP的熒光強度在增加麥芽糖濃度時因MBP與麥芽糖結合發生的變化，即結合相關熒光強度變化（BRIC，Binding Realted Intensity Change）。它表明，MBP的熒光信號受麥芽糖結合的影響（圖2B），利用BRIC信號可從第二個維度解析二者親和力常數KD≈10 µM，從而實現結合測量的正交估計。
圖2.（A）由FIDA在25°C分析的MBP和麥芽糖之間的相關結合曲線。即MBP的Rh隨麥芽糖濃度（0-1000 µM）變化的函數曲線。（B）與單獨的MBP（實線）相比，當存在麥芽糖（虛線）時，指示劑峰的原始數據曲線變得更窄。
結論
本文的數據顯示了如何使用FIDA技術對蛋白質的構象變化進行測量。FIDA通過測量蛋白質的流動性半徑（5 µL樣品消耗）來深入評估活性以及局部和全局蛋白質結構變化。在一個平臺，同時采用2種方法解析分子互作親和力常數，正交測量，相互驗證。
分子互作與穩定性分析系統
FIDA技術無論在傳統的生物大分子、小分子互作分析，還是三元復合物，血清、血漿、粗提物中互作分析都有很好的適用性，而且在一些傳統互作技術具有挑戰性的領域，例如免純化樣本、脂質體、外泌體、GPCR互作分析領域具有獨特的優勢，FIDA技術擴展了互作方法的應用領域，非常有利于實驗平臺進行分子互作儀器技術升級。
FIDA技術在分子質量表征方面同樣優秀，一次運行只需4微升樣品4分鐘的時間即可獲取多達8個質量參數，其中流體力學半徑(Rh)和粘度（Viscosity）為絕對數值，黏性（Stickiness）是FIDA的獨家指標，聚集和多分散系數（PDI）為量化參數。FIDA可以用在任何蛋白相關的實驗，包括蛋白質控，蛋白穩定性篩選、制劑篩選等常規方向，還可在液-液相分離（LLPS），冷凍電鏡樣本制備質控、蛋白表達體系篩選等領域有很好的解決方案。
產品特點
1. 無固定相：溶液中直接檢測分子相互作用
2. 無標記或熒光標記
3. 靈敏度：Rh范圍0.5-500nm
4. 分辨率：檢測到＜5%Rh變化
5. 親和力范圍：pM-mM
6. 分析物上樣體積：≤4μL
7. 每個數據點8個質控參數
8. 適用于各種樣本類型，包括免純化蛋白、無緩沖液限制
應用領域
