內毒素是生物制品中最主要的熱原污染，極微量內毒素進入人體就會引起高熱、腹瀉、血管擴張，甚至昏厥或死亡。為最大程度地去除內毒素和避免內毒素污染，應積極優化生物制品的制備工藝。
 
不同來源的內毒素差異性較大，即使同一樣品不同的內毒素分子差異性也較大。
 
內毒素的性質差異如此之大，給內毒素的去除帶來了極大的挑戰和難題。生物制品的內毒素去除，應結合不同生物制品的不同工藝和內毒素的特點，尋找有效去除內毒素的方法。
 
在層析工藝開發中，為了更好的去除生物制品中的內毒素，需要對有內毒素與蛋白質相互作用的生物制品，添加不同的添加劑來解離或降低這種相互作用。

  內毒素是一種脂多糖，三個區域結構組成：脂質A區，核心多糖區和特異性多糖鏈區。單體分子為10kD~20kD，在不同成分的水溶液中，形成聚集體，最大可達1000kD。內毒素分子結構復雜且不均一，導致內毒素可以多種方式與溶液中的蛋白相互作用，形成復合物，大大增加去除的難度。
  層析純化利用內毒素的不同性質，可以采用離子交換層析，疏水層析，凝膠層析，復合層析等層析填料，降低和去除生物制品中的內毒素。
 
1. 離子交換層析填料：
內毒素分子的等電點PI在2左右，內毒素在pH4~8的緩沖體系中帶大量負電荷。通常與陰離子交換填料的正電荷配基相結合，并在高濃度鹽時將其去除。而在pH4時，內毒素還是帶負電荷，與陽離子交換填料不能結合，對于陽離子交換填料，可以的采用目標物結合而內毒素流穿的方式，去除內毒素。
 
因為非離子型去垢劑Triton X-100，Triton X-114和精氨酸，組氨酸等添加劑，有助于解離內毒素與樣品分子的相互作用。所以，對于有些因內毒素與樣品分子的相互作用，而在離子交換層析中內毒素去除效果不好或者內毒素濃度較高的生物制品中，可增加非離子型去垢劑和精氨酸，組氨酸等添加劑在淋洗步驟的緩沖液中，進行淋洗以降低生物制品洗脫液中的內毒素含量。
 
百林科MaXtar^® Q HR層析填料，在某重組蛋白項目中，增加精氨酸淋洗工藝步驟，可以明顯降低生物制品中的內毒素，如表1所示。  
 
2. 疏水層析填料
內毒素的疏水特性，使得在高鹽濃度（大于1.5M 硫酸銨）時容易容易聚集，且聚集體與疏水填料不結合，而部分未聚集的內毒素與填料結合緊密而不易洗脫，所以，上樣時聚集部分直接流穿而去除內毒素，而未聚集部分保留較強（小于0.4~0.5M硫酸銨），可通過鹽梯度洗脫去除結合部分的內毒素。
 
對于內毒素與蛋白質有相互作用的生物制品分離，添加非離子型去垢劑，精氨酸，組氨酸添加劑，有利于降低內毒素與蛋白質的相互作用，由于內毒素與蛋白質疏水性的不同，根據高鹽保留，低鹽洗脫的疏水特性，通過疏水層析梯度洗脫的形式，去除內毒素。在上樣樣品添加1M精氨酸，降低內毒素與蛋白質的相互作用，達到去除內毒素的目的。百林科MaXtar^® Butyl HR疏水填料，在某類病毒項目中去除內毒素效果，如表2所示。  
3. 凝膠層析填料
內毒素在一定成分的水溶液中可形成1000kDa分子量的聚集體，與蛋白分子的分子量相差較大，根據分子量大小使用凝膠層析分離，以去除內毒素。

4. 復合層析填料
復合層析填料MaXtar^® MMA與MaXtar^® MMC填料具有靜電相互作用，氫鍵和疏水作用的等多功能性質。復合層析的離子和疏水的雙重作用，在離子交換層析模式下，具有更寬的電荷結合和選擇范圍，蛋白質需在一定濃度的鹽（0~0.5M NaCl）條件下上樣，能夠進行鹽梯度和pH雙梯度進行洗脫；而在疏水層析模式下較單一的疏水填料結合更牢固，對于去除內毒素，增加了更多的選擇。
  對于內毒素的去除，單一的層析方法可以達到本步的最優效果，但是并不能達到生物制品的內毒素的控制要求，通常需要多種層析工藝，進行聯用以去除去內毒素的要求。
 
層析聯用去除內毒素，應根據內毒素的性質，結合層析方法選擇性，選擇合適的層析方法進行聯用。在某重組蛋白項目中，我們進行了工藝路線優化，以四種層析方法聯用技術進行了純度和內毒素的控制，每步層析在提高純度的基礎上，進一步進行內毒素的去除，整個工藝為一體，系統的去除內毒素，完成了各步的控制策略，結果見表3。 內毒素是生物制品的關鍵質量屬性，在層析純化過程中，對相關物料清潔方法，以控制和除去內毒素：層析填料的清潔再生，一般使用0.5M NaOH+1~2 M NaCl進行CIP；
 
玻璃，塑料，硅膠管等管路或器皿上的內毒素，選擇0.1~0.5M NaOH侵泡4h以上；玻璃和金屬制品，一般使用180℃加熱3~4h或者250℃加熱1~2h。

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