腫瘤的發(fā)展與腫瘤微環(huán)境息息相關。在癌癥發(fā)生中，正常組織中和諧的細胞相互作用關系被破壞，逐漸演變成適應腫瘤生長的條件。腫瘤微環(huán)境的變化，可能導致不同細胞區(qū)室的基因、蛋白表達及信號通路的改變。針對腫瘤微環(huán)境的檢測和表征研究可為癌癥治療提供新的思路。

傳統(tǒng)分析技術受取樣精確度以及分析靈敏度的限制，無法精準獲取靶向部位，而對其中特異代謝物的差異表征就更加困難。激光顯微切割技術可以方便地對特定的組織區(qū)域精確分離。結(jié)合高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用檢測技術，從而將空間定位準確的微區(qū)細胞代謝譜進行全面準確的表征。

 

實驗設計

樣品制備：

將腫瘤組織做冰凍切片，樣本置于徠卡LMD7激光顯微切割載物臺；接收端放置PCR管用于分離體的接收。選擇合適切割面積 ( ~1,000,000µm²用于代謝物建庫；~20,000µm²用于大樣本靶向分析)開始進行切割（圖1）。切割完成后，小心收集樣品。共收集到來自10個病人的原位癌 (25份)、浸潤癌 (18份)、癌旁組織 (13份) 樣本共46份，每一份在平行的兩張張切片上同樣位置分別收集作為代謝組學和脂質(zhì)組學分析。

圖1. 組織切片樣本用于激光顯微切割分離體制備。經(jīng)過蘇木精-伊紅（HE）染色確定組織切片中不同類型的細胞區(qū)域（左）包括原位癌、浸潤癌和癌旁細胞，在平行的未染色組織切片中的相應位置進行激光顯微切割獲得分離體（右）。

樣品提取：

裝有樣品的PCR管加入50µL提取溶液（代謝組學樣本：甲醇:乙腈:水 2:2:1, v/v；脂質(zhì)組學樣本：二氯甲烷:甲醇 1:1, v/v），振蕩混勻，超聲15 min，離心后將全部溶液轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中待LC-MS/MS分析。

LC-MS條件：

樣品通過ExionLC^™系統(tǒng)分別串聯(lián)SCIEX ZenoTOF 7600和SCIEX Triple Quad 7500 系統(tǒng)進行代謝物建庫和大樣本量靶向代謝組學/脂質(zhì)組學分析。

實驗結(jié)果：

數(shù)據(jù)通過SCIEX OS 軟件3.1中的定性、定量功能處理。在代謝組學樣本中共檢出100個代謝物，脂質(zhì)組學樣本中共檢出502個代謝物，并將這些化合物在所有的樣本進行峰面積提取。將獲得的各種組織中化合物含量信息進行生物統(tǒng)計學分析，以浸潤癌組織v.s.癌旁組織為例，尋找表征區(qū)分這兩種組織的差異代謝物。以t-檢驗p-value值小于0.05以及PLSDA分析VIP值不小于1作為篩選條件，對這兩種組織的區(qū)分，共找到84個差異代謝物（圖2）。

圖2. 浸潤癌組織v.s.癌旁組織中的差異代謝物熱圖。通過統(tǒng)計學分析，包括t-test的p值小于0.05以及PLSDA計算的VIP值不小于1作為篩選條件，獲得了84個差異代謝物。

小結(jié)

通過對組織切片進行激光顯微切割獲取空間定位準確的微量樣本，并與SCIEX ZenoTOF 7600和SCIEX Triple Quad7500系統(tǒng)相結(jié)合，實現(xiàn)微量細胞水溶性和脂溶性代謝物的全面表征以及高靈敏度組學分析。

可將此方案應用于其他組織切片樣本，助力空間組學研究的開展。

感謝SCIEX中國的支持

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