亞微米分辨紅外測量系統mIRage在亞細胞無標記化學成像中的應用

瀏覽次數：988　發布日期：2024-10-9　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

O-PTIR技術

O-PTIR (Optical Photothermal Infrared)是一種快速簡單、非接觸式的光熱紅外技術，突破了傳統IR衍射的極限。該技術不依賴于殘留的IR 輻射分析，而是通過檢測因本征紅外吸收引發的樣品表面快速的光熱膨脹或收縮，來反映微小樣品區域的化學信息。

O-PTIR 技術已廣泛應用于生命科學中的各個領域，尤其是細胞與亞細胞水平的原位分子結構研究，如檢查亞細胞位置的淀粉樣蛋白折疊。

非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統——mIRage

美國PSC公司基于新型光熱紅外（O-PTIR）技術，研發了全新非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統——mIRage。設備不僅具備傳統FTIR的特性，可以對物質的分子結構進行解析，還克服了傳統紅外空間分辨率不足的問題，其分辨高達500 nm，可在亞微米尺度上實現單個細胞與組織的無標記含水分析，如對單個細胞內蛋白、脂質等生物大分子的無標記探測。本文將結合三篇高水平文獻概述該技術在亞細胞水平無標記成像的能力。

非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統——mIRage

一、單神經元細胞中β淀粉樣蛋白無標記成像分析

瑞典隆德大學的Oxana Klementieva與Gunnar K. Gouras團隊使用非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統——mIRage和X射線熒光直接對神經元中的微量元素和相關分子結構進行化學成像，在這一研究中該團隊使用mIRage對單神經元細胞中β淀粉樣蛋白的分布和結構進行了分析，該成果在2021年以Correlative optical photothermal infrared and X-ray fluorescence for chemical imaging of trace elements and relevant molecular structures directly in neurons為名發表在Light: Science and Applications（影響因子20.6）上。

在這項研究中，作者結合了兩種位于電磁波譜兩端的成像模式用于直接評估單個神經元中的結構和化學信息。通過非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統——mIRage和同步加速器 X 射線熒光 (S-XRF) 納米成像技術的無標記超分辨率微光譜進行亞細胞成像并捕獲了同一神經元中β淀粉樣蛋白的纖維形式。該研究發現在原代AD樣神經元中，鐵簇與升高的淀粉樣蛋白β片層結構和氧化脂質共定位。

該團隊首先使用mIRage可視化了β淀粉樣蛋白片層結構和氧化脂質的分布（下圖a）；隨后，使用S-XRF可視化了相同神經元中金屬離子的分布（圖b）。通過擬合mIRage和S-XRF圖像可以發現金屬鐵簇的位置與升高的β淀粉樣蛋白片層結構和氧化脂質高度相關（圖c和d）。

該研究運用mIRage/S-XRF聯合單細胞成像技術，成功證實了聚集鐵與升高的β淀粉樣蛋白片層結構共定位的顯著相關性，表明使用 Aβ(1–42) 治療可能導致Fe失衡，進而可能引發脂質氧化。

二、腦組織切片中β淀粉樣蛋白無標記成像分析

上述團隊瑞典隆德大學的Oxana Klementieva繼續使用非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統——mIRage表征了新提取的AD動物模型的腦組織，對淀粉樣蛋白結構形成進行了化學成像分析，該成果在2022年以Label-Free High-Resolution Photothermal Optical Infrared Spectroscopy for Spatiotemporal Chemical Analysis in Fresh, Hydrated Living Tissues and Embryos為題發表在Journal of the American Chemical Society（影響因子14.4）上。

在該研究中，作者使用非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統——mIRage檢測了新提取的含水組織，從而避免了傳統紅外檢測制樣中必須要通過大量操作排除水分子干擾而無法對蛋白分子進行原位結構研究的弊端。

結果表明，mIRage可對從各種器官（包括活體大腦和肺組織）中提取的未處理、完全水合的組織活檢樣本進行化學成像分析。借助mIRage，該團隊跟蹤了功能性腦組織中淀粉樣蛋白隨時間的結構變化，首次觀察到新形成的淀粉樣蛋白的出現，而淀粉樣蛋白結構在標準固定和脫水程序后發生了改變。

如下圖所示，該團隊以對 APP/PS1模型小鼠腦切片中相同的淀粉樣斑塊進行時間分辨觀察。為了可視化 β淀粉樣蛋白的片層結構，該團隊獲取了 1656、1630 和 1680 cm-1 頻率的紅外圖，這是淀粉樣蛋白的雙波段特征。由于氧化脂質先前與淀粉樣蛋白結構相關，該團隊還獲取了頻率為 1740 cm–1 的圖譜，以使用 1656 cm–1 圖譜作為相應比率圖譜的分母來檢測氧化脂質 (圖C)。該團隊在該時間點觀察到具有β片層結構的新小斑點的形成 (圖A下中箭頭指示的2張圖像)，其中反向平行β片層結構含量較高(圖 B下，箭頭所示)。新β片層結構的出現伴隨著氧化脂質的存在增加，而氧化脂質的存在伴隨著 AD 組織中的淀粉樣蛋白聚集（圖C、D）。

該研究證明了非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統——mIRage無需標記即可直接對新鮮的生物樣本進行檢測，分辨率達亞微米水平，代表了生物組織原位化學成像分析技術的新突破。

三、單細胞脂質代謝成像分析

加州大學圣巴巴拉分校的Kenneth S. Kosik研究組以棕櫚酸疊氮化物（azide-PA）作為探針，使用非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統——mIRage檢測體外細胞模型中新合成的脂質以研究細胞脂代謝。該成果以Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems為題發表在Nature communication（影響因子16.6 ）上。

在該研究中，作者構建了一個單細胞代謝成像平臺，能夠在各種人類衍生的 2D 和 3D 培養系統中以高特異性直接成像脂質代謝。通過加入疊氮化物標記的紅外探針（azide-PA），可用作核苷酸的修飾標記，脂肪酸代謝的分子探針；azide-PA加入培養基后，可被細胞利用合成甘油三酯，磷脂和固醇類。mIRage檢測azide-PA的光譜結果顯示和PA相比，其在2100cm-1具有疊氮基團的吸收峰，因此azide-PA非常適合用于檢測細胞內的脂質分布。該團隊通過此體系在前顆粒蛋白敲低的人類誘導多能干細胞及其分化的小膠質細胞中發現了上調的脂質代謝。

如下圖所示，該團隊將hiPSC與神經膠質細胞在含有azide-PA的培養基中培養24h后，通過mIRage成像發現，神經膠質細胞在2096 cm-1和1744 cm-1的信號強度（圖A&圖B），及總脂質/蛋白比（1740/1650）與新合成脂質/總脂質比（2096/1740）均高于hiPSC（圖C&圖D），表示在hiPSC分化過程中脂質的合成更加活躍，脂質的合成可能與早期腦發育有關。

以上研究結果表明， mIRage可以在亞微米水平進行高分辨率的單細胞化學成像分析，O-PTIR技術與紅外探針結合的單細胞代謝成像，將帶來更多生物領域的新發現，助力開發更有效的疾病療法。

mIRage的特有優勢：
• 亞微米空間分辨的紅外光譜和成像（~500 nm）；
• 與透射模式相媲美的反射模式下的圖譜效果；
• 非接觸測量模式—使用簡單快捷，無交叉污染風險；
• 很少或無需樣品制備過程(無需薄片), 可測試厚樣品；
• 可透射模式下觀察溶液中的樣品；
• 實現同時同地相同分辨率的IR和Raman測試；
• 熒光顯微成像實現熒光標記樣品快速定位。