腦-心膽堿能突觸-鈣信號傳導介導缺血性卒中誘發房顫的機制研究
神經系統和心血管系統聯系緊密，全球超 150 萬人因神經心源性機制死亡，其中卒中后的心血管并發癥較為常見。房顫（atrial fibrillation, AF）在急性缺血性卒中患者中更常見，卒中后檢測到的房顫可能由多種原因引起，理解其潛在機制至關重要。卒中引起房顫的實驗動物模型仍然缺乏，阻礙了該卒中-心臟綜合征（Stroke-heart syndrome; SHS）作用機制的發現和針對性治療方法的開發。
基于此，天津中醫藥大學朱彥教授團隊聯合河南省醫學科學院電生理研究所郝國梁博士團隊在Theranostics 雜志上發表了"Brain-to-heart cholinergic synapse-calcium signaling mediates ischemic stroke-induced atrial fibrillation"相關文章。
文中建立缺血性腦卒中導致的房顫大鼠模型，揭示膽堿能受體介導的鈣信號通路異常是 SHS 的關鍵發病機制，并發現抗心律失常復方中藥穩心顆粒可有效逆轉該綜合征的發生，為腦心綜合征的基礎研究和治療方法提出了新的思路。
研究方法：
本文采用熒光標測技術（Optical Mapping）來檢測不同模型組的動作電位及鈣瞬變信號，包括動作電位持續時間、鈣瞬變持續時間、傳導異質性和空間不一致的交替等電生理特性，同時采用單細胞鈣成像技術檢測單個心肌細胞 RyR2 和 SERCA 的功能，并評估穩心顆粒的治療效果。
研究結果：
1. 缺血性卒中引起的竇性心律不齊可被穩心顆粒（WK）抑制
通過 TTC 染色腦切片評估腦梗死，大腦中動脈閉塞（MCAO）后模型組梗死體積增加。缺血后大鼠用不同劑量 WK 或美托洛爾治療，腦缺血引起心律失常可被二者劑量依賴地抑制。S1S1 高強度頻率刺激使模型組大鼠房速 (AT) /房顫 (AF)更頻繁、AERP/APD 降低，WK 和美托洛爾可抗心律失常。在 S1S1 起搏中，模型組竇房結恢復時間長、易發生竇性心律不齊及 AF/AT，WK 和美托洛爾可減短竇房結恢復時間。（圖1）
圖1. 缺血性卒中引起的竇性心律不齊可被 WK 抑制
在竇性心律下，腦缺血使一系列動作電位指標發生顯著變化，包括動作電位傳導時間、 APD90 延長等，而 WK 不同劑量組或美托洛爾治療可改善這些變化。使用 6 Hz 刺激來校正由于竇性心律差異引起的傳導差異，6 Hz 刺激顯示腦缺血引起 APD90 延長等可被 WK 或美托洛爾抑制。當周期持續時間（S1S1 為 100-50 ms）縮短時房顫易發生，模型組動作電位交替空間不一致性突出，而 WK 低、中、高劑量組及美托洛爾組可在一定程度上抑制這種不一致性。（圖2）
圖2. 通過離體光學標測得到的缺血性卒中誘導的房顫（ISIAF）在 WK 治療前后的動作電位持續時間（APD）和鈣瞬變持續時間（CaT）變化
3. 缺血性卒中引起的鈣瞬變（CaT）改變可被穩心顆粒（WK）恢復
鈣瞬變受細胞內鈣信號調節，在竇性心律中，缺血性卒中鈣瞬變發生變化，包括 CaT90 延長等，而 WK 不同劑量組及美托洛爾可改善這些變化。6 Hz 刺激條件下顯示腦缺血引起的 CaT90 延長等可被穩心顆粒或美托洛爾改善。通過縮短周期長度誘導心房交替變化，模型組的 CaT 交替變化比率在特定時間段高于假手術組，而 WK 不同劑量組及美托洛爾可部分減輕這種交替變化比率。（圖2）
通過不同方法展示鈣瞬變恢復過程，發現 ISIAF 大鼠心臟鈣瞬變恢復曲線陡度增加及衰減時間常數增加，WK 和美托洛爾可改善，單細胞鈣成像和缺血性卒中大鼠實驗進一步支持 ISIAF 大鼠模型有效及穩心顆粒的作用。（圖3）
圖3. 展示在有或沒有穩心顆粒治療的缺血性卒中誘導的房顫模型中，與房顫相關的變化以及鈣釋放的恢復情況
4. 篩選出由缺血性卒中誘導的房顫 (ISIAF) 改變且能被穩心顆粒恢復的心房基因
對假手術組、模型組和 WK 治療組大鼠心房組織進行 RNA-seq 分析。確定了受 WK 調節的基因，表明離子通道等相關過程重要，膽堿能突觸信號通路在受 WK 影響的經典通路中排第一，圖10 展示了部分基因變化值及 WK 改善 ISIAF 的機制示意圖。
圖4. ISIAF 及 WK 治療下大鼠心房的轉錄組測序和 IPA 分析
圖10. 膽堿能和鈣信號通路在 ISIAF 及 WK 治療在神經元和非神經元（心臟）系統中的作用示意圖
由 ISIAF 上調的基因（CHAT、SLC5A7、AChE、CACNB1、ATP2A3 和 CHRM3）用紅色箭頭表示
被 WK 下調的基因（CHAT、SLC5A7、AChE、CACNB1、ATP2A3 和 CHRM3）用藍色條紋標記
5. WK 對 ICa-L 的影響
根據圖5 所示，WK 極大地抑制 L 型鈣電流峰值。不同濃度的 WK 對 ICa-L 有影響，濃度升高時，ICa-L 逐漸被抑制，且有最大半抑制濃度。WK 對穩態激活電壓和 ICa-L 失活有影響，使激活和失活的值都有發生變化。在特定條件下，注入含 WK 的細胞外液后，ICa-L 激活的峰值電流密度降低，I-V 曲線向上移動但部分電位和曲線形狀未變。
圖5. WK 對 L 型鈣離子通道動力學調節的驗證
6. 篩選出與 CACNB1 和 CHRM3 相互作用的穩心顆粒（WK）活性成分
為檢測 WK 進入大鼠血漿的活性成分，分析不同樣本，確定 WK 有 40 種化學成分及 21 種入血成分。通過分子對接篩選出與 CACNB1 和 CHRM3 高親和力的前 5 種化合物，并用模型描繪其關系，還指出部分入血成分情況。
圖6. 大鼠血漿中 WK 活性成分的化學圖譜
圖7. 通過分子對接針對毒蕈堿型乙酰膽堿受體 M3（CHRM3）和鈣電壓門控通道輔助亞基 β1（CACNB1）的 WK 活性化合物的虛擬篩選
8. WK 的活性化合物對 L 型鈣電流（ICa-L）的影響人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rg1、白術內酯 Ⅱ、丹參酮 ⅡA、隱丹參酮和甘松新酮（濃度為 10、50 和 100 µmol/L)）對 ICa - L 無明顯抑制作用。而隨著薯蕷皂苷濃度（1、3、10、30 µmol/L)）升高，ICa - L 逐漸受到限制，薯蕷皂苷以濃度依賴的方式降低 ICa - L，其最大半抑制濃度（IC50）為 8.666±0.777 µmol/L)，在不同濃度下薯蕷皂苷可劑量依賴性地降低 ICa - L。
圖8. WK 活性化合物對大鼠心房肌細胞 ICa-L 的影響
9. WK 及其活性化合物對乙酰膽堿（Ach）激活的 HL-1 細胞的影響
HL-1 細胞研究表明，薯蕷皂苷濃度高于 100 µmol/L 時降低細胞活力，且能降低乙酰膽堿激活的 HL-1 細胞中 CHRM3 表達，1mg/mL WK 和 1 µmol/L 薯蕷皂苷作用與 CHRM3 抑制劑相似。
圖9. WK 活性化合物對 HL-1 細胞中毒蕈堿型乙酰膽堿受體 M3（CHRM3）激活的影響
研究結論：
該研究首次建立了缺血性卒中誘導的房顫（ISIAF）大鼠模型，并描述了腦缺血后心房電生理變化。分子機制分析表明，膽堿能突觸和鈣信號通路在這種腦心綜合征中起著核心作用。值得注意的是，通過使用復方中藥穩心顆粒治療，ISIAF 可部分逆轉，穩心顆粒通過調節相同的膽堿能突觸 - 鈣信號通路發揮作用。其活性成分之一薯蕷皂苷通過與 IKM3 結合并抑制 ICa-L 直接發揮作用。
本文章天津中醫藥大學朱彥教授和河南省醫學科學院電生理研究所所長郝國梁為共同通訊作者，天津中醫藥大學2021級博士研究生梁英然和河南省醫學科學院電生理研究所副所長王功新為文章的并列第一作者。
原文鏈接：
Brain-to-heart cholinergic synapse-calcium signaling mediates ischemic stroke-induced atrial fibrillation (thno.org)
