Cre小鼠配繁過程中的種系重組知識介紹
Fig 1. The schematic below shows the three types of rearrangements: inversion, deletion and translocation.
很多科研工作者希望使用其在特定組織細胞中提供的Cre重組酶來實現課題設計中預期的特異性重組。但是，在實際應用過程中，許多研究者都發現，Cre小鼠的Cre酶不像預期中一樣“可控”——在部分Cre小鼠的配繁過程中，可能會檢測到一些“非預期的重組”。遇到這種情況時，研究者需要考慮，小鼠是否發生了生殖系重組，即種系重組。
種系重組
在具體介紹種系重組的概念之前，我們先來看一個案例。
Fig 2. Nonspecific Expression of a Reporter Gene from a Genetic Cross of Oprk1Cre/wt; Rosa26lox-stop-lox-tdTomato/wt with a Wild-Type Mouse[1].
上圖中的兩只小鼠來自相同的親本小鼠。
子一代：使用Cre品系 (GeneXCre/wt) 與有LSL結構的報告基因小鼠 (ReporterLox/wt) 雜交，得到雌雄雙雜子代 (GeneXCre/wt；ReporterLox/wt)。
子二代：使用雌雄雙雜小鼠分別與雄雌野生型小鼠雜交。
左側小鼠在進行基因型鑒定時發現其沒有Cre基因表達，但外觀可見明顯紅色熒光表達；右側小鼠為左側小鼠的同窩對照，基因型鑒定發現其為正常的雙雜子代小鼠。通過進一步的腦組織切片后觀察其熒光表達發現，左側小鼠腦組織中有廣泛的紅色熒光，且在不同細胞中（在血管處）觀察到了非特異紅色熒光表達；而右側小鼠則僅觀察到目的細胞特異的紅色熒光表達。
很明顯左邊的小鼠發生了“非預期重組”，也就是我們前面提到的種系重組。
種系重組一般發生在親本小鼠（無論雌雄）基因組中同時有Cre基因和Floxed序列表達的時候。之所以會發生種系重組，是因為在某些Cre小鼠中，Cre重組酶會在其生殖系細胞中表達（如睪丸、卵巢），而Cre酶介導的重組可能發生在配體發生的二倍體階段，這種情況下產生的單倍體子細胞形成的胚胎發育得到的子二代小鼠，即使沒有Cre酶基因的表達，依然可能可以觀察到報告基因的表達。
種系重組的檢測
種系重組的發生會導致我們預期只在特定類型細胞中的重組廣泛發生在子代小鼠體內，若我們及時進行檢測發現這些問題，可能導致我們的課題研究從根本上存在漏洞（畢竟若發生了種系重組，Cre陰性的小鼠也可能已發生了廣泛重組，而Cre陰性的小鼠在很多課題中被用作對照組）。
CKO及CKI中的檢測
對于Floxed品系來說，基因型鑒定的常規引物一般設計在其loxp位點的上下游（即下圖B，C中a，b引物），以確認其loxp位點是否已發生預期插入。這種鑒定對于Floxed品系小鼠單品系繁育是足夠的，但若與Cre品系小鼠配繁后使用，僅使用這一組引物進行基因型鑒定，可能會“誤檢”部分子代小鼠的基因型。
如下圖B中第二泳道中樣本為+/+（野生型），而第六泳道中樣本則為+/-（由于發生了種系重組，導致該小鼠一半染色體上的Floxed序列已經發生了重組，即敲除，導致其無法被檢測到。而另一半染色體上無loxp位點插入），這兩種基因型的小鼠在目的基因的表達上是有很大差異的，但若僅通過a，b引物來進行基因型鑒定，會導致很大的誤差。
Fig 3. Breeding and Genotyping Strategies for Conditional KO/KI Mice[2].
使用Floxed品系與Cre小鼠配繁后，在進行常規的loxp位點插入鑒定（引物a,b）的基礎上，補充進行Cre酶是否發揮作用的鑒定（引物c）是非常重要的。這里不僅要關注Cre酶是否發揮作用，同時也要關注Cre發揮作用后，Loxp位點是否仍然存在（一般我們進行基因型鑒定所選取的組織中都會包含兩部分細胞，一部分細胞中表達Cre重組酶，另一部分細胞中不表達。因此我們的鑒定結果中理論上都應該能夠檢測到確定Loxp位點敲入的條帶，即圖B中的“Flox”位置條帶和圖C中的“KI”條帶）。
對每個子代的基因型進行WT、Floxed和KO/KI/Rec等位基因的檢測，是確保所有動物都有其預期的基因型的唯一方法。如果觀察到重組等位基因，想要確認是否發生了種系重組，可以通過檢測Cre陰性的子代來排除鼠尾或鼠耳中有Cre表達時會觀察到的嵌合重組的現象。重點是減少非預期重組，由于存在不同靶基因對Cre重組酶的敏感差異，因此細胞類型特異性的重組模式也必須在感興趣的靶基因位點上進行確認，而不僅僅是在一個單獨的報告基因位點上。因此，通過原位雜交和/或免疫染色來驗證感興趣區域的目標對于確認細胞類型的特異性和局部重組的效率非常重要。
種系重組相關的知識比較復雜，請關注我們。我們將會在后續的推文中持續為您介紹，請如Cre品系與報告小鼠配繁相關的種系重組問題、嵌合重組及受精卵重組與種系重組的區分等。
Reference：
[1] Song, A. J., & Palmiter, R. D. (2018). Detecting and Avoiding Problems When Using the Cre-lox System. Trends in genetics : TIG, 34(5), 333–340. https://doi.org/10.1016/j.tig.2017.12.008
[2] Luo, L., … Craig, A. M. (2020). Optimizing Nervous System-Specific Gene Targeting with Cre Driver Lines: Prevalence of Germline Recombination and Influencing Factors. Neuron, 106(1), 37–65.e5. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.01.008
[3] Spinelli, V. et al. (2015) Screening strategy to generate cell specific recombination: a case report with the RIP-Cre mice. Transgenic Res. 24, 803
[4] Madisen, L. et al. (2010) A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat. Neurosci. 13, 133–140
[5] Srinivas, S. et al. (2001) Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4
[6] Feng, G. et al. (2000) Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron 28, 41–51
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