新型基因編輯療法臨床前研究的關鍵模型B6-hABCA4小鼠的介紹及應用
近期，基因編輯、RNA編輯及小核酸療法領域取得多項突破性進展：
ADAR介導的RNA編輯：10月17日，Wave Life Sciences宣布全球首個基于ADAR的RNA編輯療法WVE-006完成臨床概念驗證，數據表現積極 [1]；
堿基（Base）編輯：11月6日，Beam Therapeutics將在美國血液學會（ASH）年會上公布其堿基編輯療法BEAM-101的早期臨床概念驗證數據。該療法顯著提高鐮狀細胞病（SCD）患者的胎兒血紅蛋白（HbF）水平 [2]。
CRISPR基因編輯：11月16日，Intellia Therapeutics開發的ATTR淀粉樣變性基因編輯療法Nexiguran ziclumeran的研究成果發表于《新英格蘭醫學雜志》（NEJM）。數據顯示，該療法可持久降低疾病指標超過90%，療效持續兩年 [3]。
RNA干擾（RNAi）：11月17日，RNAi療法先驅Alnylam公布其第三代TTR靶向RNAi藥物Nucresiran的早期臨床數據，單次給藥即可實現半年療效 [4]。
這些進展充分展示了基于DNA/RNA療法的巨大潛力。在此背景下，ABCA4作為首個進入臨床的RNA外顯子編輯療法靶點備受關注，或將成為下一代基因及RNA療法的重要突破方向。
ABCA4與Stargardt病（STGD）
黃斑是視網膜的中心區域，負責“高分辨率”的彩色視覺。老年性黃斑變性（AMD）和單基因黃斑變性均可能導致失明。其中，單基因黃斑變性通常發病于青少年，病情更為嚴重，患者可能逐漸喪失閱讀、駕駛或面部識別能力，最終導致中心視力喪失。最常見的單基因黃斑變性為Stargardt病（STGD），每6,500人中約有1人患病，主要由ABCA4基因雙等位基因功能喪失突變引起 [6]。ABCA4蛋白是一種位于光感受器和視網膜色素上皮細胞中的膜轉運蛋白，其主要功能是清除視紫紅質光漂白后產生的有毒代謝產物，防止這些化合物在視網膜中堆積 [7-8]。ABCA4基因的突變會導致毒性代謝產物如N-視黃基磷脂酰乙醇胺和脂褐素A2E的異常積累，從而引發視網膜色素上皮細胞和感光細胞的死亡，最終導致視網膜變性類疾病 [7-8]。
ABCA4：新型療法的“試驗田”
ABCA4基因變異約占遺傳性視網膜疾病（IRD）病例的30%，具有廣泛的患者基礎 [9]。盡管STGD是最常見的遺傳性黃斑營養不良形式，但目前尚無有效治療方法。由于ABCA4基因長度（約128 kb）及編碼ABCA4蛋白理論所需的最短序列（6.8 kb）均超過AAV載體的遞送上限（4.7 kb），傳統基因補充療法難以奏效 [10]。此外，ABCA4基因中存在超過2,200種與疾病相關的變異，大多數為錯義突變，其次為影響前mRNA剪接的突變 [11]。這些特性使ABCA4成為基因編輯和RNA療法等新型療法的重要研究方向：
反義寡核苷酸（AON）：ProQR Therapeutics開發的QR-1011通過校正異常剪接治療STGD患者 [12-13]。
RNA外顯子編輯：Ascidian Therapeutics的ACDN-01可替換ABCA4 mRNA前22個外顯子，理論上覆蓋約70%的STGD患者 [14-15]。
堿基編輯：Beam Therapeutics針對ABCA4基因常見突變開發了高效堿基編輯器，并在ABCA4人源化小鼠、非人靈長類動物和人類視網膜組織中取得了突變矯正效果 [9, 16]。
QR-1011和ACDN-01均已進入臨床試驗階段。此外，多家機構在今年的視覺與眼科研究協會（ARVO）年會上展示了多種新型療法的臨床前驗證數據。這些療法包括基因編輯（如Cas9介導的編輯、轉座子系統、SaKKH堿基編輯）、RNA編輯（如Cas13介導的RNA堿基編輯、ADAR介導的RNA編輯）、新型AAV載體療法（mini-ABCA4蛋白、雙AAV載體策略）、反義寡核苷酸（AON）以及同源性非依賴靶向整合（HITI）等 [17-18]。
人源化小鼠在基因/RNA編輯療法臨床前評估中的應用
由于人類與小鼠在基因上的差異，以及基因編輯、RNA編輯和反義寡核苷酸（AON）療法均靶向人類ABCA4基因，采用人源化小鼠模型可顯著提高此類療法的臨床前體內評估精度。例如，Beam開發的堿基編輯療法利用攜帶致病突變的人源化小鼠模型，成功評估了其體內編輯效率 [16]。
賽業生物自研ABCA4人源化模型及人源化點突變模型
賽業生物開發了ABCA4全基因組替換的B6-hABCA4人源化小鼠模型（產品編號：C001551），并在此基礎上構建了攜帶致病突變c.5461-10T>C的B6-hABCA4*c.5461-10T>C人源化點突變小鼠模型（產品編號：I001210），該模型能夠在小鼠體內成功重現人類患者中ABCA4基因的異常剪接模式。
(1) B6-hABCA4小鼠
該模型僅表達人類ABCA4基因及其轉錄本，同時保持正常的視網膜結構和光感受器功能。
圖5. B6-hABCA4小鼠成功表達人類ABCA4基因并保持正常的視網膜結構和光感受器功能。
(2) B6-hABCA4*c.5461-10T>C小鼠
該小鼠是通過在B6-hABCA4小鼠基礎上引入c.5461-10T>C突變構建。該突變導致剪接異常，產生39號外顯子跳過及39–40號外顯子跳過的異常轉錄本，并使正常ABCA4轉錄本減少，該突變也是ASO療法QR-1011的靶向位點。基因表達和測序結果顯示，該模型成功重現了患者體內的剪接缺陷和轉錄模式，為研究STGD相關療法提供了重要工具。
圖6. B6-hABCA4*c.5461-10T>C小鼠重現人類疾病患者中ABCA4的異常剪接模式。
總結
B6-hABCA4小鼠（產品編號：C001551）能夠正常表達人類ABCA4基因，并保持視網膜結構、血管形態和光感受器功能的正常狀態。基于該模型，賽業生物構建了攜帶c.5461-10T>C突變的B6-hABCA4*c.5461-10T>C小鼠（產品編號：I001210）。該突變導致異常剪接，產生跳過39號外顯子及39–40號外顯子的異常轉錄本，同時減少正常ABCA4轉錄本，成功重現了患者體內的剪接缺陷和異常轉錄本模式。這兩種模型為Stargardt病（STGD）相關的新型療法（如基因編輯、反義寡核苷酸、堿基編輯及RNA編輯）的臨床前體內評估提供了重要工具。
參考文獻
[1] Wave Life Sciences. "Wave Life Sciences Announces First-Ever Therapeutic RNA Editing in Humans Achieved in RestorAATion-2 Trial of WVE-006 in Alpha-1 Antitrypsin Deficiency." Accessed November 22, 2024. Wave Life Sciences.
[2] Beam Therapeutics. "Beam Therapeutics to Present Data Across Hematology Franchise, Including First Clinical Data for BEAM-101 in Sickle Cell Disease and ESCAPE Non-human Primate Data, at American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting." Accessed November 22, 2024. Beam Therapeutics.
[3] Fontana M, Solomon SD, Kachadourian J, Walsh L, Rocha R, Lebwohl D, Smith D, Täubel J, Gane EJ, Pilebro B, Adams D, Razvi Y, Olbertz J, Haagensen A, Zhu P, Xu Y, Leung A, Sonderfan A, Gutstein DE, Gillmore JD. CRISPR-Cas9 Gene Editing with Nexiguran Ziclumeran for ATTR Cardiomyopathy. N Engl J Med. 2024 Nov 16.
[4] Alnylam Pharmaceuticals. "Alnylam Pharmaceuticals Press Release | Nov 17, 2024 | Alnylam Announces Interim Phase 1 Data of Nucresiran (ALN-TTRsc04) Showing Rapid Knockdown of TTR that is Sust." Accessed November 22, 2024. Alnylam Pharmaceuticals.
[5] Ascidian Therapeutics. "Ascidian-IND-Acceptance-Release_FINAL.1.29.24.pdf." Accessed November 22, 2024. https://ascidian-tx.com/wp-content/uploads/2024/01/Ascidian-IND-Acceptance-Release_FINAL.1.29.24.pdf.
[6] Hanany M, Rivolta C, Sharon D. Worldwide carrier frequency and genetic prevalence of autosomal recessive inherited retinal diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Feb 4;117(5):2710-2716.
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[8] Scortecci JF, Molday LL, Curtis SB, Garces FA, Panwar P, Van Petegem F, Molday RS. Cryo-EM structures of the ABCA4 importer reveal mechanisms underlying substrate binding and Stargardt disease. Nat Commun. 2021 Oct 8;12(1):5902.
[9] Muller, A., et al. "High-efficiency base editing for Stargardt disease in mice, non-human primates, and human retina tissue." bioRxiv. April 17, 2023. Accessed November 22, 2024. doi: 10.1101/2023.04.17.535579.
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[11] Cornelis SS, Runhart EH, Bauwens M, Corradi Z, De Baere E, Roosing S, Haer-Wigman L, Dhaenens CM, Vulto-van Silfhout AT, Cremers FPM. Personalized genetic counseling for Stargardt disease: Offspring risk estimates based on variant severity. Am J Hum Genet. 2022 Mar 3;109(3):498-507.
[12] Kaltak M, de Bruijn P, Piccolo D, Lee SE, Dulla K, Hoogenboezem T, Beumer W, Webster AR, Collin RWJ, Cheetham ME, Platenburg G, Swildens J. Antisense oligonucleotide therapy corrects splicing in the common Stargardt disease type 1-causing variant ABCA4 c.5461-10T>C. Mol Ther Nucleic Acids. 2023 Feb 18;31:674-688.
[13] Kaltak M, de Bruijn P, van Leeuwen W, Platenburg G, Cremers FPM, Collin RWJ, Swildens J. QR-1011 restores defective ABCA4 splicing caused by multiple severe ABCA4 variants underlying Stargardt disease. Sci Rep. 2024 Jan 6;14(1):684.
[14] Doi A, Delaney C, Tanner D, Burkhart K, Bell RD. RNA exon editing: Splicing the way to treat human diseases. Mol Ther Nucleic Acids. 2024 Aug 16;35(3):102311.
[15] Jeff Bessen, Vivek Mittal, and Ned Wydysh. "Recruiting the Messenger RNA: The Future Role of RNA Editing in the Clinic." Health Advances Blog. Accessed November 22, 2024. Health Advances.
[16] Sullivan, J. (2023, May). In Vivo Genetic Eye Disease Correction Using Split AAV-Mediated Adenine Base Editing. Beam Therapeutics. Retrieved November 22, 2024, from https://beamtx.com/media/xovmia2l/202305_asgct_jack-sullivan_stargardt.pdf
[17] Vázquez-Domínguez I, Öktem M, Winkelaar FA, Nguyen TH, Hoogendoorn ADM, Roschi E, Astuti GDN, Timmermans R, Suárez-Herrera N, Bruno I, Ruiz-Llombart A, Brealey J, de Jong OG, Collin RWJ, Mastrobattista E, Garanto A. Lipopeptide-mediated Cas9 RNP delivery: A promising broad therapeutic strategy for safely removing deep-intronic variants in ABCA4. Mol Ther Nucleic Acids. 2024 Sep 26;35(4):102345.
[18] Association for Research in Vision and Ophthalmology. "Investigative Ophthalmology & Visual Science (IOVS) - Volume 65, Issue 7." Accessed November 22, 2024. IOVS.
ADAR介導的RNA編輯：10月17日，Wave Life Sciences宣布全球首個基于ADAR的RNA編輯療法WVE-006完成臨床概念驗證，數據表現積極 [1]；
堿基（Base）編輯：11月6日，Beam Therapeutics將在美國血液學會（ASH）年會上公布其堿基編輯療法BEAM-101的早期臨床概念驗證數據。該療法顯著提高鐮狀細胞病（SCD）患者的胎兒血紅蛋白（HbF）水平 [2]。
CRISPR基因編輯：11月16日，Intellia Therapeutics開發的ATTR淀粉樣變性基因編輯療法Nexiguran ziclumeran的研究成果發表于《新英格蘭醫學雜志》（NEJM）。數據顯示，該療法可持久降低疾病指標超過90%，療效持續兩年 [3]。
RNA干擾（RNAi）：11月17日，RNAi療法先驅Alnylam公布其第三代TTR靶向RNAi藥物Nucresiran的早期臨床數據，單次給藥即可實現半年療效 [4]。
這些進展充分展示了基于DNA/RNA療法的巨大潛力。在此背景下，ABCA4作為首個進入臨床的RNA外顯子編輯療法靶點備受關注，或將成為下一代基因及RNA療法的重要突破方向。
圖1. 全球首個體內RNA外顯子編輯療法ACDN-01于年初獲批進入臨床試驗 [5]。
ABCA4與Stargardt病（STGD）
黃斑是視網膜的中心區域，負責“高分辨率”的彩色視覺。老年性黃斑變性（AMD）和單基因黃斑變性均可能導致失明。其中，單基因黃斑變性通常發病于青少年，病情更為嚴重，患者可能逐漸喪失閱讀、駕駛或面部識別能力，最終導致中心視力喪失。最常見的單基因黃斑變性為Stargardt病（STGD），每6,500人中約有1人患病，主要由ABCA4基因雙等位基因功能喪失突變引起 [6]。ABCA4蛋白是一種位于光感受器和視網膜色素上皮細胞中的膜轉運蛋白，其主要功能是清除視紫紅質光漂白后產生的有毒代謝產物，防止這些化合物在視網膜中堆積 [7-8]。ABCA4基因的突變會導致毒性代謝產物如N-視黃基磷脂酰乙醇胺和脂褐素A2E的異常積累，從而引發視網膜色素上皮細胞和感光細胞的死亡，最終導致視網膜變性類疾病 [7-8]。
圖2. ABCA4蛋白在光感受器桿外節中的定位及其在視覺循環中的作用 [8]。
ABCA4：新型療法的“試驗田”
ABCA4基因變異約占遺傳性視網膜疾病（IRD）病例的30%，具有廣泛的患者基礎 [9]。盡管STGD是最常見的遺傳性黃斑營養不良形式，但目前尚無有效治療方法。由于ABCA4基因長度（約128 kb）及編碼ABCA4蛋白理論所需的最短序列（6.8 kb）均超過AAV載體的遞送上限（4.7 kb），傳統基因補充療法難以奏效 [10]。此外，ABCA4基因中存在超過2,200種與疾病相關的變異，大多數為錯義突變，其次為影響前mRNA剪接的突變 [11]。這些特性使ABCA4成為基因編輯和RNA療法等新型療法的重要研究方向：
反義寡核苷酸（AON）：ProQR Therapeutics開發的QR-1011通過校正異常剪接治療STGD患者 [12-13]。
RNA外顯子編輯：Ascidian Therapeutics的ACDN-01可替換ABCA4 mRNA前22個外顯子，理論上覆蓋約70%的STGD患者 [14-15]。
堿基編輯：Beam Therapeutics針對ABCA4基因常見突變開發了高效堿基編輯器，并在ABCA4人源化小鼠、非人靈長類動物和人類視網膜組織中取得了突變矯正效果 [9, 16]。
QR-1011和ACDN-01均已進入臨床試驗階段。此外，多家機構在今年的視覺與眼科研究協會（ARVO）年會上展示了多種新型療法的臨床前驗證數據。這些療法包括基因編輯（如Cas9介導的編輯、轉座子系統、SaKKH堿基編輯）、RNA編輯（如Cas13介導的RNA堿基編輯、ADAR介導的RNA編輯）、新型AAV載體療法（mini-ABCA4蛋白、雙AAV載體策略）、反義寡核苷酸（AON）以及同源性非依賴靶向整合（HITI）等 [17-18]。
圖3. 反義寡核苷酸（AON）療法QR-1011通過抑制病理性突變導致的外顯子跳躍來治療STGD [12]。
人源化小鼠在基因/RNA編輯療法臨床前評估中的應用
由于人類與小鼠在基因上的差異，以及基因編輯、RNA編輯和反義寡核苷酸（AON）療法均靶向人類ABCA4基因，采用人源化小鼠模型可顯著提高此類療法的臨床前體內評估精度。例如，Beam開發的堿基編輯療法利用攜帶致病突變的人源化小鼠模型，成功評估了其體內編輯效率 [16]。
圖4. A-to-G堿基編輯器（ABE）在ABCA4 G1961E人源化小鼠體內成功實現突變矯正 [16]。
賽業生物自研ABCA4人源化模型及人源化點突變模型
賽業生物開發了ABCA4全基因組替換的B6-hABCA4人源化小鼠模型（產品編號：C001551），并在此基礎上構建了攜帶致病突變c.5461-10T>C的B6-hABCA4*c.5461-10T>C人源化點突變小鼠模型（產品編號：I001210），該模型能夠在小鼠體內成功重現人類患者中ABCA4基因的異常剪接模式。
(1) B6-hABCA4小鼠
該模型僅表達人類ABCA4基因及其轉錄本，同時保持正常的視網膜結構和光感受器功能。
(2) B6-hABCA4*c.5461-10T>C小鼠
該小鼠是通過在B6-hABCA4小鼠基礎上引入c.5461-10T>C突變構建。該突變導致剪接異常，產生39號外顯子跳過及39–40號外顯子跳過的異常轉錄本，并使正常ABCA4轉錄本減少，該突變也是ASO療法QR-1011的靶向位點。基因表達和測序結果顯示，該模型成功重現了患者體內的剪接缺陷和轉錄模式，為研究STGD相關療法提供了重要工具。
總結
B6-hABCA4小鼠（產品編號：C001551）能夠正常表達人類ABCA4基因，并保持視網膜結構、血管形態和光感受器功能的正常狀態。基于該模型，賽業生物構建了攜帶c.5461-10T>C突變的B6-hABCA4*c.5461-10T>C小鼠（產品編號：I001210）。該突變導致異常剪接，產生跳過39號外顯子及39–40號外顯子的異常轉錄本，同時減少正常ABCA4轉錄本，成功重現了患者體內的剪接缺陷和異常轉錄本模式。這兩種模型為Stargardt病（STGD）相關的新型療法（如基因編輯、反義寡核苷酸、堿基編輯及RNA編輯）的臨床前體內評估提供了重要工具。
參考文獻
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[3] Fontana M, Solomon SD, Kachadourian J, Walsh L, Rocha R, Lebwohl D, Smith D, Täubel J, Gane EJ, Pilebro B, Adams D, Razvi Y, Olbertz J, Haagensen A, Zhu P, Xu Y, Leung A, Sonderfan A, Gutstein DE, Gillmore JD. CRISPR-Cas9 Gene Editing with Nexiguran Ziclumeran for ATTR Cardiomyopathy. N Engl J Med. 2024 Nov 16.
[4] Alnylam Pharmaceuticals. "Alnylam Pharmaceuticals Press Release | Nov 17, 2024 | Alnylam Announces Interim Phase 1 Data of Nucresiran (ALN-TTRsc04) Showing Rapid Knockdown of TTR that is Sust." Accessed November 22, 2024. Alnylam Pharmaceuticals.
[5] Ascidian Therapeutics. "Ascidian-IND-Acceptance-Release_FINAL.1.29.24.pdf." Accessed November 22, 2024. https://ascidian-tx.com/wp-content/uploads/2024/01/Ascidian-IND-Acceptance-Release_FINAL.1.29.24.pdf.
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[17] Vázquez-Domínguez I, Öktem M, Winkelaar FA, Nguyen TH, Hoogendoorn ADM, Roschi E, Astuti GDN, Timmermans R, Suárez-Herrera N, Bruno I, Ruiz-Llombart A, Brealey J, de Jong OG, Collin RWJ, Mastrobattista E, Garanto A. Lipopeptide-mediated Cas9 RNP delivery: A promising broad therapeutic strategy for safely removing deep-intronic variants in ABCA4. Mol Ther Nucleic Acids. 2024 Sep 26;35(4):102345.
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