熒光顯微技術在生命科學、醫學研究和藥物開發等領域廣泛應用，可對生命活動進行細胞和亞細胞水平觀測。其基本原理是利用熒光探針標記生物體內特定結構，通過探測熒光信號獲取相關信息。熒光的基本物理指標包括強度、波長、時間和偏振等，其中對熒光偏振信息的利用及新型偏振熒光顯微成像技術的研發受到越來越多關注。自20世紀50年代以來，偏振熒光顯微技術不斷發展，涵蓋多種偏振調制技術和成像系統，其相關應用拓展到細胞和亞細胞尺度，涉及多種生物結構和生物體。

浙江大學光電科學與工程學院極端光學技術與儀器全國重點實驗室魏明哲團隊從偏振熒光成像原理出發，對目前存在的多種偏振熒光顯微成像技術進行原理介紹和現狀分析，列舉了其在生物醫學領域的相關應用，討論了其發展趨勢及前景，旨在為該領域的科研人員了解偏振熒光顯微成像技術提供參考。

偏振熒光成像原理
一、熒光的偏振特性
熒光物體吸收和輻射通常被視為各向同性，但實際采用偶極子或更高階模型對熒光偏振特性建模更準確。從經典物理學角度，熒光偶極子吸收過程的吸收率與激發光和吸收偶極矩夾角余弦值平方成正比，輻射電場與光傳播方向和輻射偶極矩有關，這體現了熒光吸收和輻射過程中能量分布不均一的偏振特性。

二、偏振成像調制方法
最初依據熒光輻射過程中的偏振特性（熒光各向異性），通過測量熒光偏振系數或各向異性系數來定量分析生物大分子取向信息及動態變化，但熒光分子旋轉和熒光共振能量轉移會導致去極化現象，影響測量。后來提出熒光線性二向色性偏振顯微成像技術，利用熒光吸收過程中分子對偏振光方向的選擇性來避免去極化影響，通過測定不同方向線偏振激發光對應的熒光輻射強度之比測定生物樣本中偶極子取向信息及其動態變化。

三、偏振成像的空間-角度表征理論
熒光各向異性和線性二向色性偏振顯微成像技術在測量生物分子取向分布方面有一定應用，但存在局限性，無法獲得整幅圖像中完整取向順序信息。2019年Chandler等提出空間-角度熒光顯微鏡基本理論，從希爾伯特空間出發對消球差透鏡建模，推導出成像模型，并采用球諧基對偶極子空間-角度成像模型進行描述，實現了從偶極子取向二維平面解析到三維空間解析的跨越，對偏振顯微成像系統發展意義重大。

基于偏振調制的熒光顯微成像技術
一、寬場偏振熒光顯微技術
基于熒光線性二向色性的偏振顯微成像技術最早出現在寬場熒光顯微鏡中。2006年Vrabioiu等用其研究活酵母菌隔膜蛋白結構；2011年DeMay等提出相關成像系統并用于測量綠色熒光蛋白偶極矩取向；2015年Abrahamsson等開發的MF-PolScope可實現多個偏振態和多達25個焦平面的同時成像，獲取瞬時三維圖像。

二、共聚焦偏振熒光顯微技術
共聚焦熒光顯微技術與偏振調制結合可更好地探測偶極子取向。2003年Bigelow等設計了可用于熒光各向異性成像的激光掃描共聚焦熒光成像系統；2013年Kress等提出共聚焦偏振熒光顯微技術，能量化細胞膜分子取向順序；Wang等后續改進提高了采集速率，相關技術在巨型單層囊泡和COS-7細胞上得到驗證。

三、光片偏振熒光顯微技術
光片熒光顯微鏡具有獨特優勢，光毒性和光漂白效應小，軸向分辨率高且可三維快速成像。2018年Markwardt等首次將偏振熒光成像應用于光片顯微技術，用于觀測活體線蟲胚胎；后提出雙視角倒置偏振光片熒光顯微技術，實現熒光分子三維空間強度和三維分子取向聯合重構，但存在噪聲抑制相關問題，浙江大學課題組提出改進方法，解決了現有方法的諸多問題。

四、雙光子偏振熒光顯微技術
2007年馬輝課題組利用熒光各向異性表征生物分子旋轉動力學和相互作用；2009年Gasecka等提出偏振雙光子顯微技術，可定量測量脂質和細胞膜中局部靜態分子取向，具有諸多優勢；Lazar等發現雙光子偏振熒光顯微鏡檢測靈敏度更高；Ferrand等從數學上證明了取向測量所需偏振測量次數，并提出相關數據處理方法完善了理論。

五、寬場超分辨分子取向顯微技術
偏振熒光顯微鏡受衍射極限影響，北京大學席鵬研究團隊研發多種技術解決。2016年的SDOM技術可解析亞衍射極限體積內偶極子有效取向；2019年的pSIM技術將偏振激發看作結構化照明，提升了分辨能力；2023年提出的新型高速自偏振同步調制3DSIM系統和三維取向映射顯微技術，分別實現了三維高速超分辨成像和高時空分辨率下熒光偶極子三維取向測量。

六、單分子取向定位顯微技術
偏振調制用于單分子定位顯微鏡，早期通過激發光偏振變化激發分子線性二向色性進行單分子二維取向估計，后引入多個照明角度估計三維方向，還可通過探測端偏振分裂獲取分子取向信息，但方向估計需校準光學像差。2023年Zhang等開發的raMVR顯微鏡結合偏振探測和光瞳分裂技術，實現了單分子精度的六維成像，具有出色性能。

七、基于偏振調制的分辨率增強顯微技術
偏振可提升空間分辨率。2014年Hafi等提出SPoD技術，通過旋轉線偏振光激發和相關算法處理，提升了空間分辨率；2018年Zheng等開發P-TIRF顯微技術，通過偏振調制器實現快速偏振調制，提升了三維樣品結構重建精度；此外，利用衍射圖案對熒光團方向和位置的依賴性也可提高空間檢測精度，如Lew等研究發現偏振成像可抑制偶極子徑向偏振光，提高定位精度。

生物醫學應用
一、膜類結構觀測
早期利用偏振熒光顯微鏡測量生物分子轉動特征，如1990年Florine-Casteel成像單層囊泡測量脂質順序；羰花青染料常用于標記膜類結構，1979年Axelord研究其在紅細胞膜中的取向；1990年Dix等測量細胞細胞質粘度；2013年Wang等測量COS-7細胞細胞膜結構；2023年Zhang等研究淀粉樣蛋白-脂質相互作用，對研究神經退行性疾病發病機制意義重大。

二、蛋白質類結構觀測
隔膜蛋白具有熒光偏振特性，2006年Vrabioiu等用寬場偏振熒光顯微鏡觀察活酵母隔膜蛋白，解決結構爭議；2011年DeMay等確定其在活細胞中的組織情況；2015年Abrahamsson等揭示芽殖酵母細胞分裂中的蛋白質組裝過程；2016年席鵬課題組實現活酵母細胞中隔膜蛋白和核孔復合蛋白的超分辨偶極子成像。肌動蛋白參與眾多細胞生命過程，2012年Vishwasrao等研發相關成像方法，2016年和2023年席鵬課題組分別實現其超分辨偶極子取向測量和精確測量分子結構。微管在細胞中起重要作用，2023年席鵬課題組發現其新結構特征，表明其與肌動蛋白和肌球蛋白協同作用促進膜管化。

三、其他生物醫學應用
熒光偏振可用于藥理學篩選測定，測量藥物-蛋白質或蛋白質- 蛋白質相互作用。Dubach等使用多光子熒光各向異性顯微鏡實現細胞和亞細胞尺度下活體實時體內藥物分布和相互作用測量，2014年首次實現靶標結合與未結合小分子藥物實時可視化；2016年Vinegoni等開發相關顯微鏡，在體外和小鼠腫瘤體內具有高分辨率和深穿透能力，對新型藥物開發有重要指導意義。

總結與展望
偏振熒光顯微技術作為一種強大的成像工具，與傳統熒光顯微技術專注于熒光分子的位置和濃度信息不同，它能夠額外獲取生物分子的結構取向信息，這一特性使其在生物醫學研究領域中占據著獨特且重要的地位。在單分子結構研究中，它有助于深入了解分子層面的微觀結構和相互作用；在蛋白質結構研究方面，能夠為解析蛋白質的組裝、功能發揮機制提供關鍵線索；對于生物細胞膜結構的研究，更是可以揭示細胞膜的組成、動態變化以及與周圍環境的相互作用等奧秘。

然而，現有的偏振熒光顯微技術仍面臨諸多挑戰與局限。在分子三維取向觀測方面，盡管已經取得了一定進展，如通過單分子取向成像和光片顯微成像技術在分子三維取向成像上有所突破，但目前大多數基于二維平面的分子取向觀測方法仍難以避免偏差。全面且精確的分子三維取向觀測，迫切需要更為優化的偏振調制設計，以及在成像模型和圖像重構理論方面的創新。

盡管面臨諸多挑戰，但偏振熒光顯微技術的發展前景依然廣闊。隨著科技的不斷進步，有望在理論研究、技術創新和實際應用等多個方面取得突破，為生物醫學研究帶來更多的驚喜與發現，進一步推動該領域向更深層次、更精準化方向發展，從而為揭示生命活動的本質和疾病的發病機制提供更有力的支持，也為新型藥物研發、精準醫療等應用領域開辟新的道路。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：魏明哲, 劉鈞宇, 郭敏, 劉華鋒. 偏振熒光顯微成像技術及研究進展（特邀）[J]. 激光與光電子學進展, 2024, 61(6): 0618011.