HL-60細胞培養實驗步驟、培養技巧及常見問題
HL-60細胞是通過白細胞分離術從一名患有急性早幼粒細胞白血病的 36 歲白人女性的外周血中分離出來的早幼粒細胞。 HL-60 自發分化，丁酸鹽、次黃嘌呤、佛波醇肉豆蔻酸（PMA，TPA）、DMSO（1% to 1.5%）、放線菌素D和視黃酸可以促進分化。細胞表現出吞噬活性，并對趨化刺激有響應。致癌基因myc表達陽性。HL-60人急性早幼粒白血病細胞系可用于免疫紊亂和免疫學研究。
HL60細胞屬于急髓白血病M3細胞株,穩定表達t（15，17）染色體核型以及PML融合基因，細胞總體形態為圓形，細胞膜清晰，細胞質呈多顆粒狀。
ATCC細胞庫HL-60細胞圖片
細胞庫HL-60細胞圖片
HL-60細胞培養實驗準備提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風10min，用75%酒精擦拭臺面。
器材耗材：玻璃瓶、培養瓶、培養皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭（白色0-10ul；黃色20-200ul；藍色100-1000ul）、濾器、吸管、多孔培養皿、6cm皿、10cm皿，培養瓶等。
試劑：IMDM培養液、緩沖液、PBS、消化液、血清、抗生素。
HL-60細胞培養條件
形態特征：淋巴母細胞樣，懸浮生長
培養基: 80%IMDM+20%FBS +PS
生長條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃
傳代方法：1:2至1:4，每周 3次
凍存條件：無血清凍存液（或者冷凍保存液：90%血清，10%DMSO，現用現配），液氮儲存
HL-60細胞收貨注意事項
1.收貨時需鏡下拍照（看密度、狀態）
2.靜置后需鏡下拍照（看整體密度）
a.如密度50%以下，建議換液并豎瓶培養
b.如密度50%-80%，建議換液培養，隔天觀察密度
c.如密度90%，建議傳代
3.換液及傳代處理前，培養瓶豎著放置至少半小時（使細胞沉到瓶底）；收集上清，必須將瓶內所有培養基（70ml）全部收集！并用PBS（10ml）潤洗瓶底并收集!離心轉速為1000rpm，5min。
操作步驟
HL-60細胞復蘇方法
1.將含有1 mLHL-60細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養基混合均勻；
2.在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養基后輕輕吹勻；
3.將所有HL-60細胞懸液加入含適量培養基的培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養基，培養過夜）；
4.第二天換液并檢查HL-60細胞密度。
HL-60細胞傳代方法
如果HL-60細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
方法一：收集HL-60細胞，1000RPM條件下離心3-5min分鐘，棄去上清液，補加1-2ml培養液后吹勻，將細胞懸液按1:2到1:4的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。
方法二：可選擇半數換液方式，棄去半數培養基后，將剩余HL-60細胞懸起，將細胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。
HL-60細胞凍存方法
待HL-60細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例
a.收集HL-60細胞及細胞培養液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，然后進行細胞計數。
b.根據HL-60細胞數量對應加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
HL-60是⽬前已⽤于科學研究的⼈類⽩⾎病細胞系，最初是分離⾃⼀名36歲的⼈類⼥性急性早幼粒細胞⽩⾎病患者。
HL-60細胞以懸浮培養的形式在含有營養和抗⽣素的培養基中持續增殖，倍增時間約為 36 ⾄ 48 ⼩時。HL-60 細胞表現出嗜中性早幼粒細胞（neutrophilic promyelocyticmorphology） 形態，隨后進⾏的評估則指出其出⾃成熟的急性⾻髓性⽩⾎病。HL-60細胞通過在細胞表⾯表達的轉鐵蛋⽩及胰島素受體進⾏增殖。如果從⽆⾎清培養基中除去轉鐵蛋⽩或胰島素受體其中⼀項， HL-60 細胞的增殖就會⽴即停⽌。通過⼆甲基亞砜或維A酸的化合物，可以誘導其分化為成熟的粒細胞;⽽⾻化三醇、佛波醇-12-⼗四烷醯-13-⼄酸酯及顆粒⽩⾎球-巨噬細胞集落刺激因⼦等的化合物，則可以分別誘導HL-60細胞分化為單核細胞、巨噬細胞樣或嗜酸性粒細胞表型。
HL-60細胞系科研用途
HL-60細胞可以⽤作研究⽣理學、藥理學和病毒學因素對髓樣分化的影響。HL-60細胞模型已經應⽤于研究DNA拓撲異構酶 IIα 和 IIβ 對細胞分化和凋亡的影響，并且特 別適⽤于介電泳研究。此外，研究⼈員已使⽤HL-60細胞來研究細胞內的鈣是否在活性氧誘導的胱天蛋⽩酶激活中發揮到作⽤。HL-60細胞及衍⽣的分化細胞，它們的染⾊質和基因表達譜研究是近年進⾏的研究。
如何養好HL-60細胞經驗分享
1.細胞形態觀察。細胞膜是每天必須觀察的，看是否清晰, HL60細胞的死亡往往是從細胞膜的破裂開始的，早期的表現就是細胞膜某一點出現欠完整或者毛發影。
2.HL-60細胞在高密度下狀態比較好，細胞狀態好時會吸收一些細胞碎片；
3.低密度時細胞狀態很差，傳代比例要控制，當培養密度達到1x106/mL左右時可傳代，細胞狀態不好時后面傳代可以不用離心；
4.DMSO會對HL-60刺激分化，建議復蘇馬上離心去除DMSO；
5.懸浮細胞對血清要求高，選用優質血清培養；
6.培養過程中盡量不動或少動培養瓶。
7.HL60細胞往往會有"抱團" 現象，抱團生長或死亡，勤換液或傳代，盡量避免細胞抱團。
8.HL60細胞生長迅速，強烈建議用較大的培養瓶養，用小瓶養的話，換液不及時,很容易死亡。HL60細胞的生長速度一般為2天左右就需要傳代。
9.HL60細胞對胎牛血清高度依賴。培養液PH應調為7.20-7.40之間。
10.防污染。HL60細胞生長迅速，較少發生污染，但常規措施應該做好。比如無菌操作，酒精消毒等，培養瓶口建議過火，包括瓶蓋，應過火4秒左右。
11.凍存。-20℃小時, -80℃過夜，液氮長期保存。強烈建議液氮長期保存，盡量不要在-80℃長期保存，死亡率很高。
12.復蘇。調節水浴箱溫度為42°C，并提前在試管內放置10倍培養液，使培養液溫度與室溫一致。1分鐘內融化細胞（禁止搖晃凍存管），移取至試管內，動作要輕，從試管管底開始慢慢，上提移液管，使細胞在培養液內分布均勻，離心，洗2次。
HL-60細胞培養常見問題
1.HL-60細胞生長慢、狀態差怎么辦
當細胞傳代后生長速度慢且狀態不佳時，可豎著培養直到培養基變黃，待細胞密度起來后，狀態會有所好轉。
同時，若HL-60細胞狀態很差，可采用半換液的方式：
以T25瓶子為例，瓶子里有5mL培養基，豎起瓶子靜置一段時間（豎瓶前拍拍瓶子，讓輕貼底部的細胞團浮起來），待細胞沉底（肉眼觀察細胞沉底情況），小心吸出2.5mL的培養基，轉移到離心管，離心1000rpm 3~5min，用2.5mL新鮮培養基重懸后再放回原瓶。
2.HL-60細胞什么時候傳代
HL-60細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養，
3.HL-60細胞貼壁嗎
HL-60細胞是懸浮細胞，不是貼壁細胞。
4.HL-60細胞用什么培養基
HL-60細胞培養基是80%IMDM+20%FBS +PS
5.HL-60細胞致瘤嗎
Yes, in nude mice（subcutaneous myeloid tumors） .Yes，in semi-solid media。
6.HL-60細胞受體表達情況
complement, expressed;Fc, expressed。
7.HL-60細胞基因表達情況
tumor necrosis factor （TNF），also known as tumor necrosis factor alpha（TNF-alpha, TNF alpha），after stimulation with phorbol myristic acid, myc+。
8.HL-60細胞的推薦接種密度是多少
ATCC 建議在補充有 20% 優質胎牛血清的 IMDM中以 1.0-2.0 x 10 5 個活細胞/ml 的密度接種。這些細胞通常會從冷凍保存中緩慢恢復并作為單細胞懸浮液生長。HL-60細胞在條件培養基中生長良好，只需每 2 或 3 天培養瓶中添加一些新鮮培養基即可。應經常進行細胞計數，以確保細胞密度不超過 1 X 10 6 個細胞/ml。
