原創為：烏拉烏拉 來源于：生物制藥小白

概述

本文概述了噬菌體展示技術在展示、篩選、策略等方面的進展，是一篇值得進一步深入探究的綜述。后續公眾號會依照本文對噬菌體展示技術的各部分進行經典文獻內容提取展示。主要內容概述如下：

1、抗原展示：直接或間接固定展示；通過脂質體、納米盤和 VLPs 展示；全細胞淘選展示

2、篩選技術：負篩（抗原標簽、載體、脂質體、納米盤和 VLPs、全細胞、表位特異性去除、復雜抗原混合物的去除 ）、競爭篩選、交叉淘選、抗體阻斷、NGS技術、共同抗原、環境名感條件篩選

3、特殊文庫設計：雙特異性文庫、共同輕鏈文庫、共同重鏈文庫、CDR-H3文庫、側-環文庫、組氨酸富集文庫、

4、一般文庫設計重點：抗原免疫原性要求、多樣性要求、文庫側重設計（擴增特定種系、刪除不利種系、刪除某些影響工藝的序列等）

正文

簡介

噬菌體展示技術最早發明于 1985 年，用于展示多肽，后來在 1990 年，第一個抗體片段被展示在噬菌體上。從那時起，該技術已成功用于發現數百種抗體，用于研究、診斷和治療，其中超過 14 種抗體獲得臨床批準。噬菌體展示方法的各個方面都得到了改進和提高，從而能夠發現針對具有挑戰性靶點的抗體和具有特定結合特性的抗體。與其他展示技術相比（如核糖體、酵母或哺乳動物展示技術），噬菌體展示的優勢之一是可以創建大型文庫（多樣性大于 10 的 11 次方個獨特的克隆）并存儲以備選擇，從而可以發現針對廣泛抗原的高親和力抗體。在本綜述中，我們將討論四個主要參數，這四個主要參數可以通過優化來改善抗體發現活動的結果：抗體展示形式的選擇、抗原展示、選擇策略和文庫構建。

噬菌體展示文庫中使用的抗體形式

噬菌體展示文庫可以使用不同的噬菌體來展示各種不同的抗體形式，如絲狀 M13、fd 和 f1 噬菌體。兩種最常用的形式是單鏈可變片段(scFvs) 和抗原結合片段 (Fabs)。ScFvs 是由 VH 和 VL 結構域通過短的多肽連接子組成的小型（25-27 kDa）單價抗體片段。Fabs 大小為 50 kDa，由 VH、VL、CL 和 CH1 結構域組成。ScFv 轉換為 Fab/IgG 形式時可能會失去親和力，這點在以 Fab 形式發現的抗體上則很少出現。但是，Fab 通常比 scFvs 的表達率低，在噬菌體上的展示水平也較低，因此，scFvs 是一種更穩健的文庫形式，尤其是在天然庫中。

其他抗體形式也可用于構建抗體噬菌體展示文庫，包括人單域抗體（人 VH）以及駝科和鯊魚單域抗體（分別為 VHH 和 VNAR）。VHHs 較小(12-15 kDa），由純重鏈抗體的抗原結合片段組成。在傳統抗體中，介導 VH 和 VL 配對的界面包含被掩埋在界面中的疏水殘基。在 VHHs 中，這些殘基被親水性更強的殘基所取代，從而提高了水溶性，降低了形成聚集體的趨勢。與傳統抗體相比，VHH 中的互補性決定區 3（CDR3）環通常被拉長，這使得 VHH 能夠結合傳統抗體不能結合的抗原，如酶活受體結構域的催化區域。VNAR 抗體片段在大小上與 VHH 抗體片段相似，但有一個明顯的例外，即它只有兩個 CDR 環，因為 Fr2- CDR2 區域的大部分被刪除了。

在噬菌體展示活動中選擇哪種抗體形式取決于所發現抗體的最終用途。如果應用是治療性的且需要長半衰期，或者需要效應細胞的參與，scFv 或 Fab 庫可能是最佳選擇，因為它們可以很容易地重新轉換為常用的治療用 IgG 形式。對于研究試劑和診斷應用，或者當大規模生產的成本是主要考慮的問題時，VHH 等形式可能是最理想的選擇，盡管這種形式也可以與 Fc 區域融合，形成 VHH-Fc 分子，在半衰期和效應細胞參與方面具有與 IgG 相似的特性。總之，明確最終抗體產品的要求對于選擇最合適的庫類型至關重要。

抗原展示策略

對于一個成功的基于噬菌體展示的抗體發現項目來說，所含抗原的構象必須與最終應用中抗原的構象相似。否則，發現的抗體最終只能識別改變了構象的抗原。因此，噬菌體展示活動的第一步也是關鍵的一步是確定抗原展示的最佳方法。

1、通過直接或間接固定進行抗原展示

最廣泛使用的抗原展示策略是將抗原直接或間接的固定在表面上（圖 1a）。在直接固定法中，抗原通過被動吸附涂布在表面上。這種方法是迄今為止最簡單的抗原展示方法；但它并不適合許多其他類型的抗原，因為這些抗原在吸附后會改變其原生構象。對于小抗原來講這種方法存在特別大的問題，因為該方法不能完全展示分子間的相互作用力以發揮被動吸附作用。對于上述抗原的其中一部分來講，間接固定法可用來替代直接固定法。

通過間接固定，抗原被一種捕獲分子捕獲到表面。最流行的技術是利用鏈霉親和素/中性親和素與生物素之間的強結合力，在表面包被鏈霉親和素/中性親和素，抗原通過連接子或標簽與生物素結合。這會使得抗原與表面有間接且穩定的結合。間接固定法更能使抗原最大程度的保留原始構象，因為抗原是突出于篩選表面的。然而，至關重要的是不要使抗原過度生物素化，因為這會掩蓋重要的表位或導致抗原聚集。

生物素化有兩種不同的方法：位點特異生物素化和隨機生物素化。位點特異生物素化可以使用包含酶生物素化位點的生物素化受體多肽（BAPs）來實現。AviTag 是最常用的一種 BAPs，需要將抗原與 15 個氨基酸多肽的標簽融合并重組表達。AviTag 序列的生物素化發生在賴氨酸殘基上，通過大腸桿菌生物素酶 BirA 實現的。AviTagged 抗原可在細菌細胞、酵母和哺乳動物細胞中與 BirA 共同表達，以實現體內生物素化。此外，純化的AviTagged 抗原可以和純化的 BirA 以及生物素共孵育，實現體外生物素化。利用 BAPs 的生物素化是位點特異性的，每個抗原只有一個生物素，因此可以控制抗原生物素的比例，避免過度生物素化。盡管如此，在某些情況下可能無法使用 AviTag 系統，特別是目標抗原難以或無法重組表達時，或 AviTag 會干擾抗原的潛在的重要（末端）表位時。

隨機化學生物素化法可作為 BAP 生物素化的替代方法。在這種方法中，純化的抗原和生物素化試劑通過各種可能的化學反應混合，以實現抗原和生物素之間的共價連接。有多種連接子可供選擇，可連接生物素化抗原的主要胺基（賴氨酸 N末端或側鏈）或巰基和羧基。雖然化學生物素化比酶法生物素化（通過大腸桿菌生物素連接酶）更快、更便宜，但其需要滴定才能達到所需的 1:1 的抗原生物素比例。

抗原的間接固定可基于不同的肽標簽和標簽特異性捕獲分子。這需要融合肽標簽的抗原重組表達以及篩選表面和融合的標簽特異性捕獲分子共包被。標簽和捕獲分子間的結合導致抗原的固定。盡管與生物素-鏈霉親和素系統相比，His-標簽和抗-His抗體或其他 His 捕獲分子不那么流行，但它們已被用于噬菌體展示中的抗原展示。最近，從變形鏈球菌中的纖連蛋白結合蛋白中提取的肽-蛋白配體對，即 SpyTag/SpyCatcher，被用于噬菌體展示篩選中的抗原展示。Spy 標簽和 Spy 捕獲分子之間的結合是通過異肽鍵實現的，在各種條件下，如 pH、溫度和緩沖體系中，都證實這是一種不可逆、特異且扎實的方法。

2、通過全細胞淘選進行抗原展示

盡管間接固定適合于展示許多抗原，但當它要展示膜蛋白等抗原時，往往不是最佳選擇。膜蛋白通常包含疏水跨膜區并且可能是多個亞單位蛋白復合體的一部分；因此，將他們從自然環境中分離后經常會丟失原始構象。為保持其構象，膜蛋白可在細胞膜上表達（圖 1b）。哺乳動物細胞系，如人胚腎（HEK）細胞或中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，可以瞬時或穩定地轉染目標蛋白，使其過度表達并在細胞表面獲得高密度，同時保留抗原的原生構象。雖然有時會使用培養的原代細胞進行篩選，但事實證明，與原代細胞相比，培養的細胞會改變蛋白質的表達水平；為克服這一潛在問題，可使用未經培養的原代細胞進行篩選。其他細胞表達系統，包括大腸桿菌、酵母和昆蟲細胞，也可用于表達和呈現膜蛋白。

在全細胞上進行噬菌體展示篩選的一個問題是，目標抗原，無論是內源的還是重組表達的，都只占展示文庫總蛋白的一小部分。為克服這一問題，可采用下文所述的負篩技術。此外，在使用轉染細胞時，可在兩輪篩選之間改變宿主細胞，以集中篩選存在于兩種細胞上的重組抗原。另一個挑戰是噬菌體顆粒可通過其外殼蛋白（與其展示的抗體片段無關）非特異性地吸附到細胞表面。為了解決此問題，洗脫時使用低 pH 的緩沖液。此外，一些噬菌體還能與用于淘洗的細胞懸液中的死細胞和細胞碎片非特異性結合。為了減少這種非特異性 binder 的富集，需要確保篩選時所用的細胞是高活率的。

3、通過脂質體、納米盤和 VLPs 展示抗原

膜蛋白也可以展示在兩親結構上，如脂質體、納米盤和病毒樣顆粒（VPLs）（圖 1c）。脂質體是一種球形囊泡，由一個或多個磷脂雙分子層膜（通常由磷脂分子組成）所包圍的一定體積的水溶液組成。磷脂雙分子層膜模擬了質膜的環境，為展示膜蛋白提供了一個合適的平臺。在脂質體上展示的抗原需要形成脂質體，從原生膜環境中提取抗原（無論是從天然來源分離還是重組表達），最后將提取的抗原轉移到預形成的脂質體上。當重組表達時，抗原需要與標簽融合，以便后期純化。

膜蛋白還可以展示在納米盤上，是納米大小的圓盤結構，由兩條兩親的螺旋蛋白帶（膜結構蛋白，即 MSPs）包圍的磷脂雙分子層組成。純化的膜蛋白可與磷脂和 MSPs 混合以獲得攜帶膜蛋白的納米盤（圖 1c）。蛋白帶限制了雙分子層的大小，因此與脂質體相比，納米盤的大小分布更加單分散和一致。此外，納米盤為膜蛋白提供了更穩定的環境，與脂質體相比可以保存更長時間。此外，由于其盤狀結構，加入納米盤中的蛋白質可從膜的兩側接觸到。這在需要接觸膜蛋白的細胞外和細胞內結構域時非常有利。脂質體和納米盤都可用于展示離子通道和多次跨膜蛋白，如離子通道和 G 蛋白偶聯受體，這些蛋白直到最近才被證明難以表達/純化。然而，脂質體和納米盤都依賴去垢劑提取膜蛋白，這會改變蛋白質的結構。作為一種無去垢劑的替代方法，使用苯乙烯馬來酸（SMA）共聚物可將膜溶解到脂質納米盤中，這種納米盤是由 SMA 共聚物環繞的磷脂雙分子層組成的納米大小的盤狀結構，其結構被稱為 "苯乙烯馬來酸-脂質顆粒"（SMALP）。使用無去垢劑提取的蛋白也能融入脂質體用于抗原展示。

細胞毒性蛋白過表達時可以引起宿主細胞的生長延遲和毒性，使該蛋白難以表達。細胞毒性蛋白和膜蛋白可以在無細胞的情況下進行合成，合成反應包括改良的細胞裂解液，它為目標蛋白的表達提供了合適的環境，可能與模擬結構（如脂質體和納米盤）相結合，從而捕獲并展示新合成的蛋白。膜蛋白在納米盤上的展示已經在噬菌體展示中應用。

VLPs 是另一種適于噬菌體展示的膜蛋白的展示方法。VLPs 是非感染性的、類似病毒的多蛋白結構，它沒有病毒的基因組，但含有病毒的衣殼蛋白。目標膜蛋白可以瞬轉入表達衣殼蛋白的宿主細胞中，并在其表面過表達。自組裝的病毒衣殼蛋白引導質膜出芽，從而形成綴滿目標抗原的 VLPs（圖 1c）。可以先合成 VLPs 隨后將目標蛋白共價結合在其表面上。與脂質體相比，VLPs 更為穩定，能以更高的密度呈現抗原。不過，VLPs 的成本也很高，因為商業化的 VLPs 價格昂貴，而且在實驗室中生產 VLPs也很費力。

先進的噬菌體展示篩選策略

利用噬菌體展示篩選進行抗體發現活動可以采用多種策略和方案。這些策略應經過仔細挑選，以最大限度地提高發現具有所需特征的抗體的機會。在這里，我們將介紹可用于發現具有結合特性（如交叉反應、高選擇性或 pH 依賴性）的抗體的不同策略。

1、負篩策略：抗原標簽和載體材料

在篩選過程中，針對所有抗原（包括標簽或融合伙伴）以及支持基質（如鏈霉親和素磁珠）的 binders 都有可能被篩選出來。為了克服這一問題，通常會使用非目標物進行負篩，以限制針對目標物以外抗原的抗體的富集。例如，使用鏈霉親和素磁珠對生物素化蛋白進行選擇之前，可以先將文庫暴露在與鏈霉親和素磁珠偶聯的生物素化的非目標蛋白質上，以減少進入預期目標篩選步驟的這類不需要的 binder 的比例（圖 2a）。

2、負篩策略：全細胞、脂質體、納米盤和 VLPs

同樣的原理可應用于更復雜的靶標，如全細胞、脂質體、納米盤或 VLPs。在對全細胞進行淘選時，可使用轉染細胞的方法來表達需要展示的抗原，如感興趣的表面受體，然后使用模擬轉染的細胞或未轉染的細胞來進行負篩，富集受體特異性的抗體。此外，在發現針對病毒靶標的抗體時，可以使用感染的宿主細胞作為抗原進行篩選，未感染的宿主細胞裂解液用于。對于脂負篩。使用內源性表達目標蛋白的細胞時，最理想的是，使用敲除目標抗原的相同細胞進行負篩（圖2b）。對于脂質體、納米盤和 VLPs 來講，也可采用類似策略，即在抗原展示顆粒上進行篩選之前，先使用未嵌入抗原的展示顆粒進行負篩。

更為復雜的情況是，在使用哺乳動物或細菌細胞的表型發現活動中，在事先不知道靶標的情況下使用整個細胞進行篩選。在這種情況下，可以在與靶細胞相似的非靶細胞上進行負篩，以避免針對常見細胞表面抗原的富集。然而，像轉染細胞那樣的完美匹配是不可能的。例子包括，目標是發現靶向 B細胞上的抗體，使用 T 細胞進行負篩。

3、負篩策略：復雜抗原混合物的去除

通過去除進行的負篩可用于復雜靶標，如全細胞或不純蛋白質樣本，也可用于靶標未知的情況。例如，在事先不知道靶點的情況下對全細胞進行篩選。在這種情況下，盡管靶抗原是未知的，但非靶抗原可能是已知的，這樣就可以進行蛋白去除篩選。在蛋白質去除過程中，噬菌體展示文庫與包被或捕獲在免疫試管或磁珠上的非目標抗原對應的重組蛋白質一起孵育。之后，未結合的噬菌體被轉移到目標抗原上，并用于選擇。

4、負篩策略：表位特異性去除

對于治療性抗體來說，抗體與目標抗原的哪個表位結合往往至關重要，因為這可以決定抗體是否具有治療價值。為了引導抗體與抗原的特定部分結合，可以采用不同的技術。為了找到受體的配體結合位點結合的 binders，可以通過加入高濃度配體來進行洗脫，這樣只能洗脫出與配體競爭結合的抗體。然而，這種方法最大的弊端是主要是低親和力抗體被洗脫下來，需要使用特異性的減少低親和力 binders 量的方法。抗體阻斷（Antibody blocking）也稱表位掩蔽（epitope masking）是另一種發現針對抗原特定部分抗體的策略。在篩選過程中，先前發現的與抗原非目的表位結合的抗體也會被納入阻斷范圍。這些抗體會結合并阻斷抗原的某些表位，使噬菌體上的新抗體在篩選步驟中無法接觸到某些表位。這樣，結合新表位的抗體就能得到富集（圖 2d）。除抗體外，受體-配體復合物也能以類似的方式去除那些與受體或配體一樣不識別位點相同位點的 binders。

5、競爭篩選

在許多情況下，希望減少與靶抗原相關抗原的結合力。因此，目標是將篩選集中在目標抗原獨有的表位上，減少與相關抗原共有表位的結合比例。然而，負篩并非百分之百有效，這與靶標濃度和與共享表位結合的親和力有關。抗體與抗原的結合是一種遵循質量作用定律的平衡反應。因此，并非所有抗體都能在特定時間點與抗原結合。因此，在所有的負篩策略中，有幾種抗體對用于負篩的抗原是具有特異性，但在負篩結束的時間點，這些抗體不會與抗原結合。因此，這些對用于的負篩抗原具有特異性的抗體將被帶到篩選階段，并可能在此與目標抗原結合。為了避免這種情況，可以在存在競爭抗原的情況下進行篩選（競爭篩選），作為負篩的替代方法（或與負篩相結合）。

在競爭篩選中，目標抗原和非目標抗原與抗體庫混合，使抗體在目標抗原和非目標抗原之間競爭結合。使用大量過量的非目標抗原會促使抗體與目標抗原和非目標抗原共有的表位結合，從而提高回收抗體中與目標特異性表位結合的抗體比例。因此，在篩選步驟之后，與目標抗原結合的抗體會被富集。用結合抗體收集靶標的策略包括用生物素等標記靶標，而不標記非靶標（圖 3a）。這種方法可用于全細胞和純化的蛋白。另一種方法是以不同方式呈現靶抗原和非靶抗原，如將靶抗原固定或包被在塑料表面，然后在溶液中加入非靶抗原（圖 3b）。對于全細胞篩選來講，非目標細胞也可作為膜顆粒呈現，從而產生不同密度的目標抗原和非目標抗原，這樣就可以通過離心進行分離。

與健康樣本相比，病變組織、細胞和體液中的抗原上調通常是治療或診斷的相關靶點。另一種發現這些靶點和靶向上述靶點的抗體的方法是利用表型篩選。然而，在這種情況下，使用健康樣本的經典負篩策略并不理想，因為，在負篩步驟中（健康樣本表面），所有抗原的 binders 都會減少。相反，在篩選期間包含競爭篩選可以發現這些上調靶點的抗體，不僅僅是那些特異性表達的靶點。通過改變用于競爭的非靶標抗原的添加量，這些篩選可以幫助發現針對上調到一定程度的靶標的抗體。抗體將與展示在目標抗原和非目標抗原上的抗原競爭結合，表達水平將決定抗體是主要被富集還是被清除（圖 3c）。

產生交叉反應抗體的策略

抗體是高度特異性的分子，篩選通常是為了找到特異的抗體，使其結合一種目標抗原，避免與其他分子結合。然而，在許多情況下，盡管抗體必須對目標具有高度特異性，但它們也傾向于結合同一靶標的同源物或不同突變版本。例如，如果能識別該抗原的小鼠和猴的同種抗原，那么同時與人源靶點結合的治療抗體的臨床前研究就會更容易進行。另一個例子是，感染性疾病和抗蛇毒素的開發，識別不同病毒、細菌或毒素的廣泛性中和抗體被發現就更有益。

1、交叉淘選

實現交叉反應的一種方法是進行交叉淘選，這種方法可以在篩選過程的不同輪次鐘改變抗原（圖 4a）。這種技術已被用于尋找針對艾滋病毒、流感病毒 A 株以及多種物種的蛇毒細胞毒的保守表位的抗體。成功與否取決于相關靶標之間的保守程度。對保守程度低的同源物或類似物需要廣泛的交叉反應，可能會導致找到低親和力的抗體、非特異性結合抗體或無抗體。

2、抗體阻斷和下一代測序

當同一抗原被用于重復淘選時，為了發現交叉反應抗體，可利用上文所述的抗體阻斷法引導淘選指向抗原的保守表位（圖 4b）。另一種方法是利用下一代測序技術（NGS）評估非同源蛋白平行篩選時的產出，以鑒定所有產出池中富集和發現的抗體（圖 4c）。這種方法用于發現結合血清白蛋白的 binders。

3、共同抗原

鑒別交叉反應抗體的另一種方法是在篩選中使用共同抗原（圖 4d）。共同抗原的設計方法是對多個同源抗原進行序列整合，并構建一個 "平均 "的共同抗原，在每個位點使用最常見的氨基酸。在有多個氨基酸選擇存在的位點上，可以采用不同的方法，例如基于相似的化學特性或篩選氨基酸，或選擇具有最佳預測免疫原性的氨基酸。利用共同毒素對馬進行免疫，成功地產生了針對不同蛇的短神經毒素的多克隆廣譜中和抗體，并推測使用共識抗原可能會在基于噬菌體展示的抗體發現活動中非常有用。

4、篩選環境敏感的抗體

在注射治療抗體時，抗體在被細胞內吞前一直處于循環狀態。內吞后，抗體被引導至溶酶體，在那里它們可以被再次釋放至循環中，因為與新生兒受體（FcRn）結合。然而，當抗體與抗原結合時，抗原-抗體復合物被內化，要么在溶酶體內降解，要么被再次投入循環。為了避免抗原或者不需要的抗體碎片循環，可以將抗體改構成在酸性內體中從抗原上釋放，當抗體進入循環時抗原則被降解（圖5a）。對于治療性抗體來講，這樣改構可以降低藥物的給藥劑量或者給藥頻率。鑒于血液循環（pH7.4）和內含體（pH5.8））的 pH 不同，我們需要的是在不同 pH 對抗原有不同親和力的抗體，這樣抗體就會在非載模式下進入循環。與傳統抗體相比，使用 pH 依賴的抗體可降低血漿中的抗原濃度，該抗體還可以被設計為 FcRn 親和力增加版本的抗體。此外，pH 依賴的結合可增強抗體藥物偶聯物的細胞毒性，并可能促進抗體穿過血腦屏障。為發現依賴 pH 的抗體，可對噬菌體篩選步驟進行修改，以豐富這一特性。在篩選過程中，中性 pH 值時產生結合，隨后將 pH 降至 5.4，使得依賴 pH 值的結合體被洗脫。使用富含組氨酸的文庫可以提高發現 pH 依賴的 binder 的機會，文章后續會詳細說明。

提高抗體半衰期的另一個策略是使抗體的結合依賴于離子的存在。在內涵體和血漿中，鈣離子的濃度存在差異。因此，在同樣 pH 依賴的條件下，鈣離子依賴可以被用于將抗體從內體中循環出來。例如，在含鈣緩沖液中篩選 IL-6R，然后加入 EDTA 來螯合 Ca2+，從而將鈣依賴性抗體洗脫下來，結果發現了一種能加速清除血漿中抗原的抗體。

根據抗體的最終用途，可在篩選過程中附加額外要求，如提高穩定性或減慢清除率。一種增加穩定性的方法是增加溫度或者在篩選過程中增加蛋白酶，用以富集在上述條件下穩定的抗體。在發現慢速解離抗體時，通常會在連續的篩選步驟中降低抗原濃度，并添加額外的洗滌步驟。

體內噬菌體展示篩選

如前所述，使用全細胞作為抗原進行噬菌體展示篩選是一種有效的策略，它能兼顧抗原的正確折疊、翻譯后修飾和功能性等諸多方面。然而，活體生物體內抗原的復雜性和藥理學仍是空白。由于組織微環境的變化，相似的細胞類型可能會有完全不同的表達譜或翻譯后修飾，無論是在健康組織還是在患病組織。

為了完全模擬抗原的體內圖譜，開發了體內噬菌體展示技術。噬菌體展示庫通常是靜脈注射并讓其循環，然后進行心內灌注，清除未結合的噬菌體。最后，將噬菌體從收獲的勻漿或裂解的靶組織中釋放出來，并進行測序分析。如果感興趣的靶點是已知的，則可在測序前分析抗體與靶點的結合情況。通過比較目標組織中存在的序列與輸入組織或無關組織中存在的序列，確定噬菌體的富集程度，并選擇富集序列作進一步鑒定（圖 6）。

圖6

在描述體內噬菌體展示篩選的原始文獻中，基于肽的噬菌體展示文庫被用于確定與腦或腎血管特異性結合的肽。利用這種技術還發現了 scFvs 和單域抗體（sdAbs）形式的抗體。體內噬菌體展示主要在小鼠或大鼠身上進行，但也有少數研究描述了該技術在人身上的應用。然而，在人身上不可能進行心內灌注，因為這會導致受試者死亡。為了指定特異性靶向目的組織的序列，需要對血液中的噬菌體進行分析和比較。

抗體噬菌體展示文庫的設計

如上所述，可根據所需抗體的最終要求，采用不同的篩選策略進行選擇。除了所使用的篩選方法外，還可以使用各種噬菌體展示文庫來優化獲得具有所需特征的抗體的機會。文庫可以基于不同的抗體形式、天然的或合成的抗體序列，甚至可以定制為具有特定生物物理或結合特性的抗體。在文庫構建過程中，可以采用不同的克隆策略，如輕鏈和重鏈序列的連續克隆、重疊延伸 PCR 剪接或金門克隆來連接 VH 和 VL。在此，我們將介紹一些常規文庫類型以及更先進的定制文庫設計。

根據構建文庫所用抗體序列的來源，抗體噬菌體展示文庫總體上可分為兩大類：天然文庫和合成文庫。直接從 B 細胞或利用從頭合成技術合成獲得序列。

1、天然文庫

天然文庫捕捉供體的抗體庫，可以來自特異性免疫或非免疫（"天然"）供體。抗原挑戰后的免疫反應伴隨著抗體從幼稚 IgM 到分泌型 IgG 的類別轉換。因此，天然抗體庫通常從健康供體的 IgM 庫中產生，以捕獲多樣化的抗體群。相比之下，反映供體近期免疫史的 IgG 譜系則用于免疫庫。通過體細胞高頻突變進一步驅動免疫應答，從而使親和力、表達水平和抗體特異性得到改善。因此，平均而言，從免疫庫中發現的抗體比直接從天然庫中分離的抗體具有更高的親和力。然而，抗體工程技術能將從天然庫中獲得的抗體優化成直接從免疫庫中獲得的抗體類似的水平。另一個區別是，免疫文庫通常體量較小，只能有效用于發現針對免疫的抗原或密切相關抗原的抗體，而天然文庫的應用范圍更廣。由于重鏈和輕鏈以及有時 CDR 區域是隨機組合的，沒有考慮到天然配對，因此天然庫和免疫天然文庫的多樣性都超出了本身的多樣性。

2、合成文庫

合成文庫可以用多個框架和隨機 CDRs 從頭創建，也可以根據天然抗體序列合成抗體中的特定目的區域，通常是最有可能參與抗原結合的 CDR 環。合成文庫和天然文庫在用于抗體發現方面各有利弊，下面將重點介紹。

（1）抗原免疫原性要求

創建免疫庫需要用相關抗原進行免疫。這就要求抗原具有免疫原性，這也是為什么除非從（自然）感染的病人身上清除 B 細胞，否則無法有效創建基于人類供體的人類抗原免疫庫。因此，構建有效的人抗原免疫文庫一般需要使用直系同源物種。出于治療目的，這種異源抗體必須在發現后進行 "人源化 "。然而，人源化可能會導致抗體效力的抵消，因為不能完全去除原始抗體中對結合至關重要的殘基。另外，針對自身抗原的全人源庫現在也可以通過免疫人免疫球蛋白轉基因動物進行構建。

天然庫與合成庫一樣，沒有抗原免疫原性要求，可用于發現針對所有類型抗原的抗體，包括高度保守的自身抗原以及對宿主有毒的抗原。

（2）文庫設計

這么多年以來，利用天然庫進行噬菌體展示篩選活動發現了許多治療性抗體。對治療性抗體的要求包括高穩定性和低聚集傾向。這些特性可以使抗體在高濃度時成給藥制劑，聚集低風險一般與免疫原性相關。總的來講，抗體的生物物理特性可用于預測其開發成治療藥物的難易程度，這些特性統稱為抗體的 "成藥性 "。

在某種程度上，B 細胞的成熟過程會淘汰表現不佳的抗體，因為 B 細胞的活力是通過與表面表達的 B 細胞受體水平成比例的補充信號來維持的。然而，免疫來源的抗體并不能保證好的成藥性。自然界并不要求單個抗體在血清中的濃度達到抗體藥物制劑可能需要的水平，抗體藥物制劑通常需要 100 毫克/毫升左右的濃度。因此，無論抗體來源如何，在臨床前/臨床開發過程中，當需要更高濃度的抗體時，生物物理特性有時就會出現。

在文庫構建過程中，根據所選引物從供體淋巴細胞中擴增特定種系，可提高成藥性。然而，引物與不利種系的重疊仍可能發生。在合成庫中，利用臨床證實的框架和配對的VH-VL 種系可以改善成藥性。另外，種系的框架區并非在所有人中都保守，例如 VH4b，可在設計文庫時去除該種系。

最后，去除可能影響抗體均一性和下游生產的序列缺陷也是有益的。序列缺陷包括 NXS 糖基化位點；脫氨基 NG、NS 和 NA 基序；DG 異構化；以及 M/C 氧化位點。序列缺陷的風險對于抗體的結合和功能非常重要，抗體結合部位的序列缺陷數量增加則上述風險增加。與天然文庫相比，通過對合成文庫中氨基酸的位點特異性控制，可以最大限度地減少這些與天然庫相關的基團的出現，從而節省下游工程設計的時間。

（3）文庫多樣性

發現針對所需表位的治療性抗體的核心是最大限度地提高噬菌體展示文庫中捕獲的序列多樣性。免疫文庫利用體內的天然多樣性和親和力成熟過程，富集與用于免疫的抗原特異性結合的抗體，但其使用僅限于針對該抗原和與其密切相關抗原的抗體發現活動。相比之下，如果無偏愛的天真庫和合成庫足夠大，則可用于發現針對任何感興趣抗原的結合體。

第一代天然庫通過增加供體的數量將多樣性最大化。人與人之間共享的公共克隆、抗體序列的存在影響了第一代原始文庫的真正多樣性。因此，用獨特序列數量決定的文庫規模要比用傳統方法計算的噬菌體展示庫多樣性（通過計算文庫轉化后的菌落數量）低幾個數量級。為了增加庫容，不僅要在建庫時增加供體的數量，還要簡化基因始動物料的使用數量。

使用合成文庫時，研究人員可以完全控制輸入的序列，這意味著可以去掉已知的在噬菌體上表現不佳的種系。最終，使用合成技術可以減少克隆優勢并且獲得更高的序列多樣性，一般包含＞95%的獨特序列。

雖然合成文庫能更好地用獨特的克隆填補噬菌體文庫的理論序列空間，但它們是否具有與天然文庫相同的結構多樣性還不得而知。尤其是 CDR-H3 環，它是最復雜的且對抗原特異性起最主要的決定作用 ，一般在合成文庫中被固定為窄環長度，這對某些靶點來說可能是個不利因素。因此，合成文庫理論上更大的規模可能無法轉化為比從純天然文庫中獲得的抗體更多樣化的功能。

3、專用抗體噬菌體文庫

為噬菌體展示篩選活動選擇合適的文庫是發現最佳抗體結合體的最關鍵步驟之一。影響文庫選擇的因素包括最終產品的應用、抗原的性質以及實驗室中文庫的可用性。新分子方法的出現使實驗室能夠構建自己的抗體噬菌體庫組合，以復制免疫系統提供的天然抗體譜系。這些文庫中的許多都是根據早期藥物發現的需要設計的，具有結構和序列多樣性。然而，有些應用需要由具有特定結構或序列特征的抗體組成的文庫。

（1）雙特異性抗體庫

標準人類抗體的兩個結合位點針對相同的表位，而與其相比，雙特異性抗體（bsAbs）的兩個結合位點針對不同的表位。這兩個結合位點可以針對相同的抗原（雙抗原決定簇 bsAbs），也可以針對兩種不同的抗原。在后者中，一個抗原決定簇可用于靶向特定區域或細胞，而另一個抗原決定簇則可與感興趣的抗原結合。bsAb 的典型應用是癌癥免疫療法中的 T 細胞重定向（即重定向效應 T 細胞的細胞毒活性，以特異性消除腫瘤細胞），但癌癥以外的其他疾病領域也在探索之中，如炎癥性疾病、糖尿病、病毒和細菌感染以及阿爾茨海默病。

存在大量不同的雙特異性抗體形式，包括雙特異性 IgG（bsIgGs），異源雙價 VHH 二聚體結構和 BiTEs。然而，其中一些抗體形式的制造并不簡單，例如 bsIgGs，在單個宿主細胞中生產，因為兩種不同抗體的重鏈和輕鏈共同表達會導致鏈的隨機配對和 IgG 分子的復雜混合物。最終，這種方法降低了相關 bsIgG 的總體產量，而且副產品（包括錯誤配對鏈的 IgGs）中 bsIgG 的濃度相對較低，因此需要復雜的純化技術。為了簡化表達和純化步驟，開發了許多鏈配對的方法，包括共同輕鏈或重鏈噬菌體展示文庫。這種方法允許在同一細胞中同時表達三條不同的鏈（而不是四條），得到的混合物只包含兩種單克隆抗體（mAbs）和一種 bsAb（而不是十種不同的分子）（圖 7a-c）。此外，具有共同輕鏈或重鏈的文庫還可用于發現結合結構域，這些結合結構域可用作創建新抗體形式的構件。

（2）輕鏈與共同重鏈配對

可以構建由共同重鏈和輕鏈可變基因的不同譜系構建的基于 ScFv 的噬菌體展示文庫并且將其用于篩選針對兩個不同抗原的抗體。之所以選擇固定 VH，是因為它具有有利于體外展示技術的特征，具有天然人源抗體譜系或固有的穩定性。VL 序列可以從健康人或病人的循環 B 細胞中分離出來，也可以利用先進的誘變策略在體外產生多樣性。這樣就可以分離出具有不同靶標特異性的候選抗體，它們具有相同的重鏈，但可以攜帶 κ 或 λ 輕鏈。根據其結構，這樣的全人源 bsIgG 形式，可同時攜帶一條 κ 和一條 λ 輕鏈的被稱為 κλ-body。這些專門的文庫已經成功開發出來，并被用于檢測幾種可溶性和細胞表面的人類抗原，從而發現了高親和力 IgGκ 和IgGλ。這證實了輕鏈足以驅動抗體的特異性，該文庫也可以發現用于構建靶向多個抗原的功能性 bsIgG。

（3）鏈與共同輕鏈配對

最常見的鏈配對策略依賴于使用常見的輕鏈和不同的多樣化的重鏈。

最常見的鏈配對策略是使用共同的輕鏈和不同的多樣化重鏈。這利用了 CDR-H3 的高度多樣性，這將主導在多個案例中的結合相互作用。雖然第一個基于 scFv 的共同輕鏈噬菌體展示文庫在 20 世紀 90 年代就已經出現，但隨后將其用于雙特異性抗體的難度比共同重鏈配對輕鏈更為復雜。事實上，必須對 Fc 區域的重鏈進行修飾，才能迫使兩條不同的重鏈異源二聚化（例如，"KiH "技術，使用相反的靜電荷，或在 IgG 的同源二聚體界面上嫁接異源二聚體界面）。雖然這種方法已經成功的應用于 scFv 和 Fab庫中，即從天然或免疫譜系中同時也從已有抗體中提取共同輕鏈。

最近，隨著富含組氨酸共用輕鏈的雙特異性抗體的產生，復雜性進一步增加，這使得抗體能以 pH 依賴性的方式結合靶標，下面將詳細介紹。

（4）以 CDR-H3 為重點的文庫

在抗體-抗原復合物中，免疫球蛋白重鏈和輕鏈的 CDR3 是參與抗原接觸的最重要區域。特別是 CDR-H3，展示出了最大的 CDR 多樣性，無論實在序列上還是在長度上，這種多樣性經常足以驅動抗體的特異性。因此，只需關注 CDR-H3 殘基的多樣性，就能創建具有相對較大結構多樣性的小型文庫。

研究人員已經揭示了不同物種抗體間 CDR-H3 的結構差異。例如，研究發現，雞精蛋白、駱駝類和牛類抗體的 CDR-H3 比人類抗體的更長，盡管人類也有長 CDR-H3 的例子。雞精蛋白類抗體包含一大部分與靈活性有關的小氨基酸，高親和力結合的雞精蛋白抗體通常半胱氨酸的含量增加，這樣可以構建復雜的含二硫鍵結構的長環。利用酵母展示技術或免疫后對抗原結合 B 細胞進行分選和 NGS 研究，發現了含針對表皮生長因子受體（EGFR）和補體成分 C5 的 CDR-H3 的牛抗體。這說明利用噬菌體展示技術也有可能從牛抗體庫中發現長環結合體。在駝科動物中，VHHs 往往以突出的環狀結構結合到抗原表面的凹腔中，而在牛科動物中，超長的 CDR-H3 區域形成一個 "莖和突 "獨立折疊的小結構域，類似于結蛋白結構域，它從抗體表面突出很遠，在序列和二硫化物模式上都多種多樣。這種 "迷你折疊 "都有通用的形狀和尺寸，與多個小型二硫鍵蛋白家族相似，包括蛋白酶抑制劑、離子通道阻斷劑、蛇毒毒素和 G 蛋白偶聯受體配體。因此，與傳統抗體相比，這些非典型的抗原決定簇能提供與不同表位相互作用的能力，特別是存在于許多酶、孔、通道上的凹陷表面。作為概念驗證，最近開發了一種抗體形式---"結抗體"（KnotBodies），它類似于特殊的牛抗體，顯示結蛋白結構域以代替 CDR2 環。這些結蛋白本身很難進行工程化，在體內的半衰期也很短，而抗體骨架可提高穩定性并延長半衰期。結蛋白和抗體環序列都可以進行工程化并用于噬菌體展示選擇，以優化結合選擇性，例如抗體對離子通道的阻斷效力。

總之，對其他物種抗體的其他結構特征的闡明揭示了可用于結合新型難靶表位的偏好，具有這些特征的新的專門噬菌體展示文庫正在出現。

（5） 側-環文庫

SdAbs 和抗體通過他們的 CDR 環模擬典型的結合抗原裂隙。因此，當抗原表位不同（即相當凸出）時，具有凸狀抗原決定簇的 sdAb 就不太可能與之結合。因此，研究人員通過將氨基酸多樣性的位置調整到常規環位置以外的殘基上，就能在單個免疫球蛋白樣支架上生成了一種新的識別表面。

Koide 等人觀察到，FN3 單體（從人纖連蛋白第 10 個 FN3 結構域的多樣化文庫中篩選出的抗體類似物）通過最長的環和 β-sheet 面形成結合表面。根據上述觀察，構建了單體“側面-環”文庫，在該文庫中最長的環和其臨近的 β-折疊攜帶多樣性。這相當于免疫球蛋白的 CDR3 環和 β-sheet，它們介導重鏈和輕鏈可變結構域之間的異源二聚化。使用 "側-環 "和 "僅環 "文庫進行了幾輪噬菌體和酵母展示篩選后，結果表明這兩個文庫對不同靶標的作用不同。事實上，對于一個靶標（GFP），側庫克隆比環庫克隆具有更高的親和力，而對于另一個靶標（hSUMO1），趨勢則相反。這證明了設計主要集中在側-環表面的選擇性文庫與傳統的環庫策略相比，在識別不同拓撲結構的表位上效率更高。

（6）組氨酸豐富的文庫

如上所述，抗體與抗原相互作用的 pH 依賴性對亞細胞轉運動力學和抗體再循環有一定影響。文獻中有許多從現有抗體中提取的對 pH 敏感的有效工程化抗體的例子。原理相對簡單，依賴于結合界面中加入組氨酸殘基，這些殘基在 pH 值低于 6 時可電離。當這些殘基在酸性內體中質子化時，靜電相互作用的改變會導致結構轉變，從而失去與抗原的結合。此外，參與抗原結合的可電離組氨酸殘基的總數也會影響 pH 敏感性的程度。

大多數具有 pH 敏感性結合的工程抗體都是單獨使用組氨酸掃描或從現有抗體中提取組合組氨酸掃描文庫，而從原始文庫中分離出 pH 依賴性抗體的嘗試卻寥寥無幾。第一個例子是利用富含組氨酸殘基的基于 scFv 的合成噬菌體展示文庫的優勢來尋找人類趨化因子 CXCL10 的 pH 依賴性結合體。通過在 CDR-H3 中的 8-15 個氨基酸中改變 YAT 和 NHT 密碼子構建了富含組氨酸的文庫。 然而，經過三輪篩選后，最佳克隆的 pH 依賴性太低，于是又創建了在輕鏈和重鏈的所有 CDR 中富含組氨酸的新文庫。這些基于 scFv 的新文庫最終產生了重新格式化的 IgG 克隆，在 pH 值為 7.2 時親和力低至納摩爾，而在 pH 值為 6.0 時解離速度快 22 倍。最近的另一項研究中利用組氨酸豐富和 CDR3 多樣化的 VNAR 結構域酵母展示文庫對 EpCAM 進行研究，結果發現只有一種 pH 依賴性結合體。

優化構象或序列篩選，而非抗體重新工程化（即 pH 依賴結合特性的始動篩選）事實上，可以理解的是，已經存在的抗體并不總是適合轉化為 pH 依賴性抗體。然而，僅有的兩個從頭分離的 pH 敏感抗體的例子可能表明了這一過程的難度，包括需要為 pH 依賴性和親和力成熟構建額外的子庫。此外，組氨酸介導的 pH 依賴性結合限制了合適表位的數量，因為它們需要帶正電或質子貢獻殘基。換句話說，帶負電荷或質子受體的表位理論上很難成為 pH 依賴性結合抗原的靶標。

結論
在本篇綜述中，展示了利用噬菌體展示篩選發現抗體的 4 個可以變更的參數：抗體形式、抗原展示、篩選策略和噬菌體展示庫設計。本篇綜述中提供的信息可以單獨使用，也可以在設計抗體發現活動時聯合應用，主要依賴于所得抗體的需求。

參考文獻
1、Drug Discovery Today d Volume 27, Number 8 d August 2022