嵌合抗原受體T細胞（CAR T）免疫療法是治療惡性腫瘤的新興手段，抗CD19嵌合抗原受體T細胞（CD19.CAR T）在B細胞惡性腫瘤治療療效顯著，但常伴有免疫效應細胞相關神經毒性綜合征（ICANS）這一不良反應，其臨床特征包括腦病、認知障礙、語言障礙、癲癇發作以及較少見的腦水腫。雖然ICANS致死率低（1%–2%），但其治療需要使用大劑量類固醇和免疫抑制療法，會影響CAR T細胞活性和治療效果，并增加非復發性死亡率。近期，博洛尼亞大學發表題為 “CAR+ extracellular vesicles predict ICANS in patients with B cell lymphomas   treated with CD19-directed CAR T cells”為題的文章，借助3D全自動外泌體熒光檢測分析系統揭示了CAR+細胞外囊泡（CAR+EVs）在預測和理解這種神經毒性反應中的重要作用，為研究者預防和管理CAR T細胞治療的神經毒性反應提供了新的思路，對推動 CAR T 細胞免疫療法安全應用與持續發展意義重大。

文中使用的3D全自動外泌體熒光檢測分析系統是法國Abbelight公司設計研發的，是一款無需純化、可全自動表征分析單個外泌體的創新設備。它能夠提供外泌體粒徑、亞型分布、攜帶蛋白表達及單個外泌體的膜蛋白與生物標志物共定位等全方位信息，操作簡單，結果可靠。設備特有的單分子定位成像技術，可獲得精度高達20 nm的單個外泌體的超分辨成像結果，為該研究提供了關鍵的技術支持。

3D全自動外泌體熒光檢測分析系統

 
研究者針對100名B細胞淋巴瘤患者開展實驗，為其注射CD19.CAR T細胞，在30天內一共有29人引發了ICANS。患者的血樣結果表明，患有ICANS的患者與未患ICANS的患者的CAR T細胞擴增峰值與30天內的曲線下面積（AUC）無顯著差異，但到達峰值的時間（TTP）更短（圖1），同時CAR_DNA水平到達峰值的時間也更短（圖2），這種動力學上的差異代表著CD19.CAR T細胞更快地到達病灶并激活。

圖1
 

圖2

 
先前已有研究指出，CAR   T細胞具備分泌攜帶有CAR的外泌體（EV）的能力。研究者進一步提出假設，認為CAR T血漿外泌體的檢測可以提供CAR T細胞的遷移和功能的信息。首先在含/不含CD19+靶細胞的環境下分別培養了19BBζ.CAR T和19BBζ.eGFP.CAR T細胞。24小時后，收集培養上清并使用包被了CD63，CD81和CD9抗體的玻片捕獲了外泌體，之后使用3D全自動外泌體熒光檢測分析系統進行超分辨成像可以確認在CD19+靶細胞共培養的19BBζ.eGFP.CAR   T細胞上清中含有CAR+EV（圖3A）；單外泌體STORM成像同樣確認在CD19+共培養的19BBζ.CAR T細胞上清中也含有CAR+EV（圖3B&C）；將共聚焦與STORM成像的數據結合，能夠確認19BBζ.CAR T的細胞質中含有大量CAR+EV（圖3D&E）。STORM成像結果的共定位分析可以看出，19BBζ.CAR T和19BBζ.eGFP.CAR T細胞中的大多數外泌體的CD19.CAR蛋白與CD63以單個分子的水平顯示位于同一外泌體上，即兩者共定位（圖3F&G）。以上結果表明，在CD19+靶細胞誘導下，CD19.CAR蛋白以與CD63共定位的CAR+EV的形式大量釋放到了細胞上清中。

圖3 19BBζ.CAR   T與19BBζ.eGFP.CAR T細胞的STORM/共聚焦成像分析

 
基于細胞實驗結果，研究者對接受了CAR.T治療的患者的血漿進行了流式（圖4左）和STORM檢測（圖4右），在血漿中發現了帶有外泌體和T細胞標記物的CAR+EV。進一步統計分析顯示，后續發病的ICANS患者的day+1的CAR+EV數量（圖5A），CAR+EV的藥代動力學數據（圖5B）及AUC（圖5C），CAR+EV濃度的峰值（圖5E），hour+1和day+1的水平（圖5F）均顯著增高；ROC分析顯示，hour+1時132.8   CAR+EV/μL以上的濃度的預測ICANS發生具有89.29%的靈敏度和74.58%的特異性，day+1時224.5 CAR+EV/μL以上的濃度的預測靈敏度和準確性可達96.55%和 80.36%（圖5G）。

圖4 血漿內CAR+EV的流式和單外泌體成像
 

圖5 血漿CAR+EV：早期ICANS標記物
 

在本研究中可以發現，CAR+EV的釋放是CD19.CAR T細胞在體外激活的信號，因為CAR+EV主要在識別靶細胞后釋放。3D全自動外泌體熒光檢測分析系統的STORM成像結果表明，多數CAR+EV上含有標記蛋白CD63，來源于CD19.CAR T細胞的細胞質中預組裝成的富含CD63的顆粒。STORM成像也證實了接受CAR T治療的病人血漿中含有外泌體標記物和CAR蛋白的CAR+EV；由于CD19.CAR   T細胞的激活在ICANS患者中顯著上升，血漿CAR+EV水平可以作為可信的早期ICANS指標。

參考文獻：
[1]. Storci,   G., De Felice, F., Ricci, F., Santi, S., Messelodi, D., Bertuccio, S. N., ... & Bonifazi, F. (2024). CAR+ extracellular vesicles predict ICANS in patients with B cell lymphomas treated with CD19-directed CAR T cells. The Journal of Clinical Investigation, 134(14).

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