1700nm波段多光子成像技術的研究背景及其應用
多光子成像在生物醫學特別是腦科學研究中應用廣泛，為深層生物組織結構及動力學研究提供了非侵入性和非破壞性的成像手段。生物組織的吸收和強散射特性限制了成像深度。近年來，得益于原理及技術上的進步，多光子成像在活體生物中的成像深度顯著提高。其中，1700nm波段激發的多光子成像顯著降低組織吸收及散射，與其他激發波段相比獲得了目前最大的成像深度。
多光子成像技術背景研究
技術的誕生與發展
自20世紀90年代康奈爾大學Denk等首次成功演示雙光子激光掃描顯微成像技術，多光子成像技術便在生命科學領域嶄露頭角。這項技術以其深層穿透（毫米量級）、非侵入式且無損、高空間分辨率（亞微米量級）以及強大的功能成像和動力學追蹤能力，迅速在眾多生命科學研究領域得到廣泛應用。從復雜神經網絡的描繪，到疾病的精準診斷；從神經細胞功能的深入探究，到血流變化的精確測量，多光子成像技術為科研工作者提供了前所未有的研究視角。
隨著研究的不斷深入，科研人員對多光子成像技術提出了更高的期望。在追求更高分辨率、更大視場、更快成像速度以及更深成像深度的道路上，多光子成像技術不斷演進，逐漸形成了超分辨成像、大視場成像、高速成像和深層成像等多個發展方向。這些發展方向相互交織，共同推動著多光子成像技術向更高水平邁進。
深層成像面臨的挑戰
在多光子成像技術的發展歷程中，深層成像一直是備受關注的重點領域。然而，生物組織的復雜特性卻為深層成像帶來了巨大的挑戰。生物組織的結構極不均勻，這使得激發光在其中傳播時會發生強烈的散射。同時，生物組織對激發光的吸收現象也較為顯著，對于絕大多數組織而言，主要是水吸收。這兩種因素疊加在一起，導致激發光功率隨著成像深度的增加而呈指數衰減。
以活體動物腦成像為例，常用的鈦寶石激光器在775nm波長激發時，活體小鼠腦血管的雙光子熒光成像深度僅能達到腦表面下650μm，這一深度在解剖學上僅對應于灰質層。若要深入研究腦部的白質層和海馬體等更深層結構，傳統的成像技術就顯得力不從心。為了突破這一限制，科研人員嘗試了插入光學探針、使用顯微內窺鏡或者移除大腦灰質層等方法，但這些方法都違背了多光子成像無損、非侵入的優點。
突破挑戰的策略第一種策略：是在低水吸收窗口采用更長的激發波長。研究發現，隨著激發波長增加，成像深度不斷增加。長波長激發能夠有效降低生物組織的散射，同時在水吸收較低的情況下，確保更多激發光子能夠到達樣品焦點，從而在深層產生更強的多光子信號。
第二種策略：是采用更高階非線性激發，如三光子成像。這種成像方式能夠進一步抑制表面背景信號，顯著提高深層的信號背景比。利用1665nm激發三光子熒光，科研人員實現了腦表面下2100μm的深層腦血管成像，這也是目前最深的多光子腦成像。而且，深層信號背景比達到46，顯示出三光子成像在深層成像方面的巨大潛力。
在眾多長波長激發波段中，1700nm波段憑借其獨特的優勢脫穎而出，成為了科研人員關注的焦點。它在降低組織吸收和散射方面表現優異，具有較大的有效衰減長度，理論上能夠實現比其他波段更深的成像深度，為深層生物組織成像帶來了新的希望。
1700nm波段多光子成像的原理剖析
多光子顯微成像的神奇原理
1700nm波段多光子成像技術的基礎是多光子顯微成像原理，這一原理基于非線性光學效應，展現出令人驚嘆的微觀成像能力。單光子熒光和多光子熒光在產生機制上有著顯著的區別。單光子熒光在整個激發光通路上都會產生；而多光子熒光則多個激發光子與物質相互作用，這種非線性的相互作用使得只有在焦點處才會產生顯著的熒光信號。
這種特性賦予了多光子顯微成像獨特的優勢。它不僅具有本征的三維成像能力，能夠在三維空間中精準定位目標，還具備亞微米量級的高分辨率，能夠清晰分辨微觀結構，以及毫米量級的成像深度，可深入生物組織內部進行觀測。多光子顯微成像利用近紅外波段激發，巧妙地減少了組織散射的影響，大大降低了激發光在傳輸過程中的損耗，使其能夠實現深層生物組織成像。
多光子成像的模態分類多光子成像模態豐富多樣，根據非線性激發階次的不同，主要包括雙光子、三光子以及更高階次顯微成像。雙光子顯微成像包含雙光子熒光成像和二次諧波（SHG）成像，三光子顯微成像則包括三光子熒光成像和三次諧波成像（THG）。
1700nm波段多光子成像的應用場景
活體小鼠深層腦血管成像
腦血管成像在深層腦成像中占據著重要地位，大腦中的血管為神經細胞和膠質細胞提供營養物質，同時清除代謝產物，對維持大腦正常功能起著關鍵作用。2013年，康奈爾大學Xu團隊利用棒狀光纖孤子自頻移獲得的1675nm孤子光源，首次實現了活體小鼠白質層的三次諧波成像（無標記）和海馬體三光子熒光血管成像，成像深度達到1340μm，開啟了1700nm波段多光子成像在腦血管成像領域的探索之旅。此后，科研人員不斷優化飛秒脈沖孤子光源，提升成像深度和效果，實現了活體小鼠腦表面下2100μm的深層血管成像，這也是目前1700nm波段激發活體動物三光子熒光成像的最大成像深度，相比最初的成像深度有了顯著提升。
1700nm波段激發不僅在三光子成像中表現出色，在雙光子成像方面也有出色表現。此外，科研人員還發現1700nm波段雙光子熒光血管成像已接近理論極限，而三光子熒光血管成像仍有很大的發展空間。
活體小鼠深層血流速度測量腦部的血液循環對于維持神經細胞的正常活動至關重要，血流速度成為反映神經細胞活動和某些腦部疾病的關鍵指標。多光子顯微成像技術憑借其毫米量級成像深度和亞微米量級分辨率的優勢，在血流動力學測量中得到廣泛應用。科研人員通過將熒光染料注射到動物體內，確定待測血管后進行重復線掃成像，產生明暗交替條紋，然后通過計算條紋斜率來測量血流速度。考慮到熒光標記物注射可能對活體生物造成一定影響，科研人員致力于開發無標記多光子成像血流速度測量技術。
活體小鼠深層腦細胞成像
2013年，Horton等人借助1700nm波段三光子熒光成像技術，首次在非侵入條件下實現了轉基因小鼠海馬體神經細胞成像，成像深度達1076μm。這一成果為后續研究開辟了新方向。Cheng等人利用1700nm波段三光子作用截面測量系統，對比多種熒光標記物的三光子作用截面，確定了最優激發波長和最大作用截面。他們運用腦部微針注射技術標記小鼠腦部微膠質細胞，結合1700nm波段三光子熒光成像，實現了活體小鼠灰質層和白質層的微膠質細胞成像，成像深度為1124μm，是微膠質細胞雙光子熒光成像深度的3.7倍，為深入研究腦部細胞結構和功能提供了清晰的視角。
活體小鼠頭骨及穿透頭骨成像
在自然生理環境下對活體小鼠進行腦成像研究，對神經網絡和血管成像的發展至關重要。然而，顱窗植入、開顱和頭骨打磨等手術會對小鼠腦部造成一定生理影響。例如，開顱手術可能改變顱內壓，影響血管旁流體流動；手術機械壓力會激活小鼠皮層的小膠質細胞和星形膠質細胞。因此，1700nm波段三光子成像技術成為穿透頭骨成像的重要手段。
活體小鼠深層皮膚成像
多光子顯微成像技術不僅在腦科學研究中成果豐碩，在皮膚科學研究領域也發揮著重要作用。可視化活體皮膚組織結構對皮膚疾病診斷、皮膚衰老檢測意義重大。皮膚由表皮層、真皮層和皮下脂肪層構成，1700nm波段激發三光子顯微成像已實現對活體小鼠完整皮膚的無標記成像。
髓鞘是周圍神經系統的關鍵組成部分，手指皮膚結構異常與神經病變密切相關。He等人利用1700nm波段三光子熒光成像，結合特異性熒光染料標記手指皮膚髓鞘，實現了皮膚表面下340μm髓鞘成像。此外，由于外源性熒光標記物存在毒性和光漂白問題，無標記三次諧波成像在皮膚成像中愈發重要。髓鞘富含脂質結構，能產生強三次諧波信號，利用1700nm波段三光子成像研究小鼠趾部皮膚髓鞘結構，發現無標記三次諧波成像與三光子熒光成像共定位，可實現皮膚深層髓鞘成像，且具有無標記和不受光漂白影響的優勢。
總結與展望
盡管1700nm波段多光子成像技術已取得顯著進展，但仍面臨諸多挑戰。目前，該波段激發三光子熒光成像的成像深度受激發光源和熒光標記物的限制，僅能達到2100μm。在腦細胞成像和腦細胞動力學研究方面，該技術也存在局限性。結合自適應光學技術，通過矯正生物組織導致的光波波前畸變，有望進一步提升活體生物成像深度和分辨率。開發近紅外波段的高亮度熒光探針也是關鍵方向之一。近紅外熒光探針具有光損傷小、深層組織穿透能力強、對生物樣品中生物分子背景自發熒光干擾小等優點，有利于實現更深層的組織成像。
聲明：本文僅用作學術目的。
仝申, 鐘金成, 陳新林, 邱娉, 王科. 1700nm波段超快光纖光源開發及其在多光子成像中的應用[J]. 激光與光電子學進展, 2024, 61(12): 1200001.
DOI：10.3788/LOP232274
