急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是一種全球范圍內高發病率和高死亡率的心血管疾病，嚴重威脅人類生命健康。雖然我國AMI防治工作已取得了初步成效，但仍面臨嚴峻挑戰，其發病率和死亡率仍呈上升態勢。及時有效地再灌注治療是挽救急性心肌梗死的有效手段，然而心臟血流恢復往往會進一步加重心肌損傷，這個過程稱為心肌缺血再灌注 (ischmia reperfusiom, I/R) 損傷。心肌缺血再灌注損傷機制復雜，臨床上仍然缺乏針對性的防治策略，因此，尋找調控I/R損傷的新分子機制和防治策略具有重要意義。

2024年4月2日，哈爾濱醫科大學楊寶峰院士、杜偉杰教授團隊在氧化還原領域雜志《Redox Biology》(IF:11.4)發表題為“The positive feedback loop of the NAT10/Mybbp1a/p53 axis promotes cardiomyocyte ferroptosis to exacerbate cardiac I/R injury”的研究論文。該研究通過篩選心肌缺血再灌注心臟組織基因表達數據庫，發現NAT10可能為調控心肌缺血再灌注損傷的候選基因。通過在體構建心肌細胞特異性NAT10基因敲除小鼠和過表達NAT10小鼠，離體構建原代乳鼠心肌細胞過表達和小干擾RNA干擾NAT10表達，明確NAT10缺失會改善I/R誘導的小鼠心臟功能損傷和心肌細胞鐵死亡，并且明確了NAT10調控I/R損傷的分子機制，為缺血性心臟病防治提供新策略。中國工程院院士、哈爾濱醫科大學楊寶峰教授和哈爾濱醫科大學杜偉杰教授為本文的共同通訊作者，哈爾濱醫科大學博士研究生曲哲哲、碩士龐小琛為本文共同第一作者。
 

研究材料
在本項研究中，作者采用Loxp-cre系統構建心肌細胞特異性NAT10條件敲除小鼠模型（由賽業公司提供）。腺相關病毒構建的基因過表達和敲減小鼠模型

研究方法
在本研究中采取了轉錄組，修飾組測序檢測NAT10下游靶點；CHIP, ac-RIP, co-IP等IP實驗驗證DNA-蛋白，RNA-蛋白, 蛋白-蛋白相互結合；PCR和western blot檢測RNA和蛋白表達水平；酶學試劑盒檢測小鼠心臟損傷水平；超聲心動圖分析小鼠心臟功能；透射電鏡檢測線粒體形態等。

技術路線

1. 檢測到I/R小鼠心臟NAT10表達上調，為尋找其上調原因，運用Jaspar網站預測到NAT10潛在轉錄因子P53。通過干擾P53，明確P53為I/R損傷中調控NAT10上調的啟動子
2. 構建NAT10心肌細胞特異性條件敲除小鼠，尾靜脈注射NAT10腺相關病毒,檢測NAT10對I/R小鼠心臟功能的影響。發現NAT10調控I/R誘導的心肌細胞鐵死亡的發生。
3. 通過對I/R和對照小鼠的轉錄組和修飾組測序結果的調和分析，發現Mybbp1a的mRNA發生了 NAT10催化的ac4C乙酰化修飾。
4. Mybbp1a mRNA的乙酰化修飾導致其穩定性增加，其蛋白表達水平增加，促進P53與其蛋白乙酰化酶P300的結合，從而促進P53的乙酰化激活。
5. P53作為鐵死亡抑制因子SLC7A11的轉錄抑制因子，抑制其轉錄的發生從而誘導I/R期間心肌細胞鐵死亡。
6. 通過干預Mybbp1a可以挽救過表達NAT10導致的小鼠心臟功能下降，心肌細胞鐵死亡表型。

研究結果

 
圖1 P53是調控NAT10表達上調的轉錄激活因子

首先，作者檢測了小鼠I/R損傷心臟組織中NAT10 mRNA和蛋白表達水平，發現NAT10在I/R組織中表達上調。隨后，通過Jaspar網站作者預測到P53可能是NAT10的潛在轉錄因子。通過構建NAT10啟動子的雙熒光素酶質粒，檢測得到P53與NAT10啟動子結合；CHIP實驗進一步驗證P53與NAT10啟動子相互結合。在心肌細胞中敲減P53和過表達P53，發現敲減P53下調H/R誘導的NAT10的表達增加；過表達P53上調NAT10的表達水平。在體給予P53腺相關病毒并構建I/R模型，結果表明P53缺失下調I/R組織中NAT10的表達。

圖2 NAT10誘導心肌細胞鐵死亡表型

為了進一步探究NAT10在心肌細胞鐵死亡中的作用，研究人員構建了心肌細胞缺氧12小時，復氧24小時模型，離體水平檢測到過表達NAT10在生理和病理條件下都促進心肌細胞鐵死亡；而敲減NAT10則起相反作用。

圖3 敲除NAT10可以預防I/R誘導的心肌細胞鐵死亡

為了進一步探究NAT10是否是心臟I/R損傷誘導的鐵死亡的關鍵，作者構建了心肌細胞特異性敲除小鼠模型（NAT10^CKO，由賽業生物提供）。誘導敲除后，小鼠I/R心臟的心臟功能如射血分數，短軸縮短分數得到改善，心臟梗死面積降低，鐵死亡相關Marker如GPX4的表達上調，線粒體形態恢復，脂質過氧化物產生減少。

圖4 NAT10誘導心肌鐵死亡加重心臟I/R損傷

作者進一步構建了AAV9-NAT10心肌細胞特異性過表達腺相關病毒，并對感染腺相關病毒的小鼠構建I/R模型，結果表明，過表達NAT10誘導心肌細胞鐵死亡表型。此外，作者對構建I/R模型并過表達NAT10 的小鼠心臟使用細胞死亡相關抑制劑，結果表明，與凋亡相比，鐵死亡在I/R和NAT10 誘導的細胞死亡中占主導。

圖5 Mybbp1a是介導NAT10調控I/R誘導鐵死亡的靶標

作者在對轉錄組和修飾組學測序數據的聯合分析及KEGG和GO富集分析中，探索了NAT10的ac4C修飾靶點，發現Mybbp1a的mRNA被ac4C修飾且促進其穩定性增加。我們進一步構建了Mybbp1a的腺相關病毒，并檢測了Mybbp1a的上生物學功能，發現Mybbp1a敲除可以改善I/R誘導的小鼠心肌細胞鐵死亡。

圖6 Mybbp1a逆轉NAT10誘導心肌細胞鐵死亡

作者接下來運用NAT10過表達腺相關病毒和Mybbp1a敲減腺相關病毒同時感染了小鼠心臟，并構建心臟I/R損傷模型，結果表明Mybbp1a能夠抑制NAT10誘導的心肌鐵死亡表型。據據報道，Mybbp1a通過增強p53乙酰化和在細胞應激時通過募集P300介導的轉錄激活誘導細胞死亡，作者進一步檢測了NAT10對P53和P300的結合水平，發現NAT10可以促進P300和P53的相互結合。此外，NAT10敲除也可以降低心臟I/R損傷導致的P53和P300的結合增加。以上結果表明，P53是NAT10調控心臟I/R損傷的最終效應因子，因此，作者進一步驗證了p53對鐵死亡的調控作用。已有研究表明，乙酰化的p53通過抑制SLC7A11的轉錄表達，抑制胱氨酸的攝取，并使細胞對鐵死亡敏感。因此作者實施了CHIP實驗驗證了在H/R誘導的心肌細胞中，過表達NAT10促進P53與SLC7A11啟動子的結合，而siMybbp1a則使二者結合下降。
 

圖7 Remodelin可以減輕I/R心臟損傷

上述結果表明NAT10是治療I/R的潛在靶點。為了進一步驗證這一假設，作者用一種NAT10的小分子抑制劑remodelin預處理小鼠，研究其是否能改善心臟I/R損傷。口服Remodelin顯著降低I/ r誘導的小鼠心臟梗死面積的增加及心臟功能的損傷。對I/R誘導的心肌細胞鐵死亡也具有改善作用。

綜合上述結果表明，通過藥理和基因干預NAT10可以挽救I/R損傷導致的心肌細胞鐵死亡，建立了一種可能得治療策略。

研究結論
綜上所述，本研究揭示了NAT10是心臟I/R后心肌細胞鐵死亡的重要調節因子。證明NAT10通過介導ac4C修飾增加Mybbp1a的穩定性，通過誘導P300介導的P53乙酰化和激活導致SLC7A11的轉錄抑制。同時，p53通過轉錄上調NAT10的表達，從而與NAT10/Mybbp1a/SLC7A11形成正反饋回路，加重心臟I/R損傷。這些發現提示，靶向p53/NAT10/Mybbp1a軸是治療心臟I/R損傷的新方向。