實時熒光定量PCR技術是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現其定量功能的。由于其精準度好、靈敏度高，在分子生物學研究和醫學研究等方面得到了廣泛的應用，尤其是在基因表達差異分析方面。基因表達差異分析一般是比較不同時空樣本或不同處理樣本（藥物處理，物理處理和化學處理等）之間特定基因的表達差異。

當檢測出某個基因的表達是上調或下調時，我們并不知道這種表達差異是源自于它本身表達量的變化，還是樣本量大小或者操作導致的RNA的損失等其他原因導致表達量的變化。為了減少實驗偏差并產生準確的表達水平，RT-qPCR往往需要考慮幾個變量（如操作誤差或RNA提取量、得率及變異等）進行歸一化處理。目前，RT-qPCR標準化最常用的方法是使用內參基因進行均一化處理。

什么是內參基因？

理想情況下，在所有發育階段和不同實驗處理的反應中，內參基因在不同組織的所有樣本中應具有相對穩定的表達水平。內參基因通常是各種管家基因，例如ATCB、GAPDH、β-actin、18S rRNA等。它們的表達水平受環境因素影響較小，并且可以在生物體幾乎全部組織及各個生長階段持續表達。在不同的組織中，管家基因mRNA的含量都很豐富。

內參基因的作用

在基因表達差異分析中內參基因可以用于校正上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣定量的結果才更為可信。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下不會發生表達改變的基因作內參。
 

理想的內參基因應該滿足以下條件：

1.不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA的擴增；

2.高度或中度表達，排除低表達；

3.穩定表達于不同類型的細胞和組織(如正常細胞和癌細胞)，而且其表達量是近似的，無顯著性差別；

4.表達水平與細胞周期及是否活化無關；

5.其穩定的表達水平與目標基因相似；

6.不受任何內源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響。
 

內參基因的評估

然而，已有證據表明，一些用于控制實驗偏差的傳統內參基因僅在特定條件下是相對恒定的表達水平。很明顯，內參基因是具有一定的特異性，沒有通用的內參基因可用于所有實驗的內控，這也表明在進行RT-qPCR實驗之前，必須正確選擇內參基因。那么在選擇內參基因時，可以通過geNorm、BestKeeper、NormFinder、RefGenes 等工具來評估，這是保證結果可靠準確的前提。其次可對候選的內參基因進行qPCR 實驗做進一步的篩選。首選在不同樣本中均穩定表達的內參基因，即比較各樣品中Cq平均值以及Cq值的標準偏差，選擇SD最小的基因作為實驗內參。

現在對內參基因的選擇有所了解了嗎？

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